两种染色法判定左前臂骨缺损修复骨组织的成熟度

两种染色法判定左前臂骨缺损修复骨组织的成熟度
陶云霞;王根林;袁鹏;施琴;杨惠林
【摘要】10.3969/j.issn.2095-4344.2012.37.001% 背景：苏木精-伊红染色和Masson染色是常用的两种评价骨组织修复程度的方法,但上述两种方法能否有效地评价骨缺损修复过程中骨组织成熟度,目前尚缺乏相关研究.目的：比较Masson染色和苏木精-伊红染色两种方法判定骨组织成熟度的敏感性.方法：构建新西兰白兔15 mm桡骨缺损的动物模型,植入丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞的组织工程化骨,分别于术后第4,8,12周随机选取6只动物摄X射线平片,随后处死取材,进行大体标本观察、Masson染色及苏木精-伊红染色组织学观察.结果与结论：X射线片与大体标本可见兔桡骨缺损逐渐修复,新生骨走向成熟骨.术后4周,苏木精-伊红染色在材料与骨的结合部及中间的材料上均形成大量新生软骨,有类骨样组织形成及有少量编织骨出现；Masson 染色主要表现为绿色,可见到少许红染.术后8周,苏木精-伊红染色出现更多的新生骨组织,并更趋于成熟,出现了成熟的骨细胞及大量编织骨,有血管形成；Masson染色主要表现为红-绿相间.12周时,苏木精-伊红染色新生骨逐渐改建,形成髓腔,有大量板层骨相互融合成片；Masson染色主要表现为红色.说明Masson染色结合苏木精-伊红染色能较好判定新生骨走向成熟骨的过程,但在判定骨质成熟度时Masson染色较苏木精-伊红染色更直观.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2012(000)037
【总页数】6页(P6841-6846)
【关键词】苏木精-伊红染色;Masson染色;骨缺损;骨髓基质干细胞;丝素蛋白;羟基磷灰石;骨组织;成熟度
【作者】陶云霞;王根林;袁鹏;施琴;杨惠林
【作者单位】苏州大学附属第一医院骨科,江苏省苏州市215006;苏州大学附属第一医院骨科,江苏省苏州市215006;苏州大学附属第一医院骨科,江苏省苏州市215006;苏州大学附属第一医院骨科,江苏省苏州市215006;苏州大学附属第一医院骨科,江苏省苏州市215006
【正文语种】中文
【中图分类】R318
0 引言
骨组织工程能模拟自体骨移植的骨形成过程，是修复骨缺损的理想方法[1-5]。

羟基磷灰石是一种生物活性材料，其结构及化学成分与骨组织十分相似，以羟基磷灰石作为人工骨替代材料具有组织相容性好、具有骨传导作用、可塑性强、来源充足等优点。

但羟基磷灰石强度低，且在体内几乎不能降解，一定程度上限制了其作为骨缺损修复材料的应用[6-8]。

丝素蛋白是蚕丝中提取的一种蛋白，研究表明丝素蛋白能够诱导骨髓基质干细胞分化为成骨细胞，表现出良好的骨诱导作用[9-11]。

用丝素蛋白修饰生物材料能提高细胞在材料表面的黏附和生长能力[12-15]。

杨惠林等[16-20]发现丝素蛋白修饰后的羟基磷灰石，生物相容性好，韧度强；丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料具有良好的成骨作用，在修复骨缺损中表现出较为满意的效果，是一种较为理想的修复骨缺损的新材料。

目前组织学观察仍然是评价骨缺损愈合程度的重要手段之一，其中最常用的的组织
学方法主要为Masson染色和苏木精-伊红染色。

作者在研究兔骨髓基质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石修复兔桡骨节段性骨缺损过程中[16-18,20]，采用石蜡包
埋的方法，对切片分别进行苏木精-伊红染色和Masson染色，结合X射线影像学评分，比较两种染色方法在判定骨组织成熟度中的作用。

1 材料和方法
设计：多样本观察及重复测量观察。

时间及地点：实验于2008-03/2009-05在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。

材料：
实验动物：健康新西兰大白兔18只，8-12周龄，雌雄不限，体质量2.0-3.0 kg，由苏州大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(苏)2006-2009。

实验过程中对
动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[21]。

苏木精-伊红染色和Masson染色判定骨组织成熟度实验应用的主要试剂和仪器：
实验方法：
丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料制备：丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料按照杨惠林等方法制备[16-20]：将蚕丝纤维脱胶、溶解、透析、浓缩后得到丝素蛋白溶液，以
丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，制备丝素蛋白/羟基磷灰石复合粉末，进一
步以家蚕丝素短纤维为增强材料，以NaCl为致孔剂，采用等静压的方法制备丝素蛋白/羟基磷灰石复合多孔材料。

将丝素蛋白/羟基磷灰石制备成0.5 cm×0.5
cm×0.5 cm正方体，60Co消毒备用。

兔骨髓基质干细胞的分离、培养及成骨诱导：抽取兔骨髓5 mL，将骨髓与Hank’s液混匀，以1 000 r/min离心2次，5 min/次，弃上清及脂肪层，收集
细胞。

加入Hank’s液，制成细胞悬液，再加入淋巴细胞分离液(细胞分离液与细
胞悬液体积比为1∶2)，2 000 r/min，离心半径12.5 cm，离心30 min，取有核细胞层，Hank’s液清洗，细胞以含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，细胞贴壁后首次换液，以后每3 d换液，细胞长满后传代。

体外培养第2代
细胞，置于含体积分数为10%FBS、1.0×10-7 mol/L地塞米松，50 mg/L抗坏血酸，50 mg/L维生素C，1.0×10-3 mol/L β-甘油磷酸钠的DMEM培养基，进行成骨诱导[22-23]。

细胞与材料的复合：将消毒后的丝素蛋白/羟基磷灰石置入培养皿，以DMEM浸
润24 h；取成骨诱导后第3代骨髓基质干细胞，以5×1010 L-1浓度接种到材料上，即成为材料-细胞复合体。

在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱内复合培养，
每3 d换液1次。

兔桡骨缺损模型的制备：新西兰大白兔用30 mg/kg 3%的戊巴比妥钠，耳缘静脉注射麻醉，左前臂去毛，固定后以安尔碘消毒、铺巾。

前臂内侧中上段纵行约3 cm直切口，分离肌间隙显露桡骨，用手锯将长15 mm桡骨连同骨膜一并截除，造成骨缺损[24-25]。

止血后植入丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料，缝合皮下组织及皮肤。

术后第4，8，12周摄前肢正位X射线片，参照Lane-Sandhu X射线评分标准对桡骨缺损的骨修复程度评分[26]；每个时间点随机处死
6只动物取材，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋。

Masson染色：切片厚4 μm，常规脱蜡，梯度乙醇脱水；1%桔黄G10 mL和90 mL苦味酸酶染30 min，水洗；苏木精核染15 min，自来水冲洗2 min；复合液染(丽春红+酸性复红)10 min，水洗；1%磷钨酸分化10 min，水快洗：1%亚甲
蓝染15 min；快速进入体积分数95%乙醇分色、无水乙醇脱水；二甲苯透明，中性树胶封固。

苏木精-伊红染色：切片脱蜡入水，苏木精染6 min，流水冲洗；1%盐酸处理3 s，稍冲洗；1%氨水返蓝5 s，流水冲洗；0.5%伊红染3 min，稍水洗；梯度乙醇脱
水，二甲苯透明，中性树胶封固。

主要观察指标：建模后4，8，12周骨缺损修复的Lane-Sandhu评分，Masson
染色及苏木精-伊红染色情况。

统计学分析：实验所得数据以±s表示，由第一作者采用SPSS 12.0软件进行不同时间点两两比较t 检验统计学处理，P ＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果
2.1 实验动物一般情况实验过程中无动物死亡，均在术后1 h内苏醒，术后第2
天可在笼内自由活动，正常进食，精神状态无明显变化。

2.2 骨缺损修复X射线检查骨缺损后4周X射线结果可见骨折端与材料间的间隙
较模糊，两端及缺损区有均匀的、密度较低的骨痂填充，见图1；骨缺损后8周，骨折端与材料形成骨痂连接，缺损区新骨密度增高，部分骨皮质连续，材料降解，见图2；骨缺损后12周，骨缺损已基本修复，形成皮质骨轮廓，与缺损断端相连，髓腔通畅，新骨塑形好，骨皮质连续，见图3。

骨缺损后4周放射学评分为
3.5±0.55，8周7.17±1.17，12周9.83±1.05，统计学结果显示各时间点评分差
异有显著性意义(P ＜ 0.05)，随时间延长骨修复作用明显增强。

Figure 1 At 4 wk after bone defects of rabbit left forearm, the gap between the fracture end and silk fibroin/hydroxyapatite/bone marrow stromal stem cells composite material was vague, and both ends of the fracture
and the bone defects were filled with callus图1 兔左前臂骨缺损后4周后可
见骨折端与丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料间的间隙较模糊，两端及缺损区有骨痂填充
Figure 2 At 8 wk after bone defects of rabbit left forearm, the fracture end and silk fibroin/hydroxyapatite/bone marrow stromal stem cells composite material was connected with the callus, and the material was degraded图2
兔左前臂骨缺损后8周骨折端与丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料形成骨痂连接，材料降解
Figure 3 At 12 wk after bone defects of rabbit left forearm, the bone defects was basically repaired with well new bone remodeling, and the bone cortexes were canalized图3 兔左前臂骨缺损后12周骨缺损已基本修复，新骨塑形好，骨皮质连续
2.3 骨缺损修复大体观察骨缺损后4周时，缺损区植入物表面有纤维软骨样组织
包裹，与骨折端紧密连接；8周时缺损区有骨痂样硬组织形成，但骨质菲薄，小部分呈软骨样；12周时缺损区形成的新骨皮质与骨折端皮质连续，骨塑形基本完成，肉眼不易分辨缺损区，骨缺损修复。

2.4 骨缺损组织学观察
骨缺损后4周：苏木精-伊红染色在材料与骨的结合部及中间的材料上均形成大量
新生软骨，有类骨样组织形成及有少量编织骨出现，见图4a；Masson染色主要
表现为绿色，可见到少许红染，见图4b。

Figure 4 At 4 wk after bone defects of rabbit left forearm, a large number
of new cartilage or bone-like tissues were observed on joint part between fracture end and silk fibroin/hydroxyapatite/bone marrow stromal cells
and on the intermediate materials (Arrows)图4 兔左前臂骨缺损后4周时骨折端与丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料的结合部及中间材料上均形成大量新生软骨或类骨样组织(箭头所示)
骨缺损后8周：苏木精-伊红染色出现更多的新生骨组织，并更趋于成熟，出现了
成熟的骨细胞及大量编织骨，有血管形成，见图5a；Masson染色主要表现为红-绿相间，见图5b。

骨缺损后12周：苏木精-伊红染色新生骨逐渐改建，形成髓腔，有大量板层骨相
互融合成片，见图6a；Masson染色主要表现为红色，见图6b。

Masson染色新生骨质红染少，主要呈绿色，新生骨在成熟过程中呈绿色至红-绿相间，骨质越成熟，红染越多。

Figure 5 At 8 wk after bone defects of rabbit left forearm,mature bone cells and a large number of woven bones were observed on joint part between fracture end and silk fibroin/hydroxyapatite/bone marrow stromal cells, and the blood vessel formation could be seen (Arrows)图5 兔左前臂骨缺损后8周时骨折端与丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料结合处可见成熟的骨细胞及大量编织骨，有血管形成(箭头所示)
Figure 6 At 12 wk after bone defects of rabbit left forearm, a large number of lamellar bones were integrated into a block, and the of new medullary cavity could be seen on the joint part between fracture end and silk fibroin/hydroxyapatite/bone marrow stromal cells(Arrows)图6 兔左前臂骨缺损后 12周时骨折端与丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料结合处可见新生骨逐渐改建，形成髓腔，有大量板层骨相互融合成片(箭头所示)
2.5 不良反应植入物无脱出或免疫排斥，切口无红肿、渗液等炎性反应，均Ⅰ期愈合。

3 讨论
全世界每年有数千万人的因各种原因导致骨缺损需要接受骨移植手术。

随着人们对生活质量的要求越来越高，“修复骨缺损，重建骨功能”是骨科医生所面临的巨大挑战[2,4,6]。

目前的骨修复技术主要是自体骨移植、同种异体骨移植和人工合成生物材料充填等[16-20,27-29]。

而衡量骨愈合最常用的组织学方法主要为Masson 染色和苏木精-伊红染色。

Masson三色主要应用于胶原染色[30]，因其色彩鲜艳而倍受组织学工作者欢迎。

本实验对骨受损后处于不同修复时期的骨组织进行Masson三色染色镜检观察，
并与苏木精-伊红染色进行对比分析。

在染色程序及试剂都一致的情况下，染色反
应的颜色决定于组织的成分。

本组实验结果显示Ⅱ型胶原对Masson三色染色呈
绿色反应，而Ⅰ型胶原呈红色反应，在新生骨走向成熟及软骨钙化成骨过程中有胶原类型的逐渐转变，从而导致了红绿相间现象。

骨质形成的早期阶段其中胶原应是由成骨细胞产生的Ⅰ型胶原，而不是Ⅱ型胶原，Masson三色染色呈现了绿色反应。

骨折骨痴新生到成熟，未钙化软骨到钙化软骨的过程中胶原的逐渐老化，老化的胶原排列更规律、更致密，交链增加，从而可能引起胶原电荷特性的改变，引起染色的变化。

本实验显示12周成熟骨胶原Masson三色染色也更红，红染也更多更广。

Masson三色对骨组织胶原的染色反应和胶原成熟程度有关，因此可以用来评价骨质的成熟程度。

特别是在骨折愈合过程中，可以做为评价骨痂成熟程度的指标，即红色着染的比例越多，骨痂越成熟。

同样也可以用此染色观察骨细胞和成骨细胞的活动状况，在细胞周围出现的绿染胶原系新生部分，细胞周围绿染区域的大小代表细胞的新近活动程度。

本实验骨损伤后早期红染区域较少，骨细胞及成骨细胞周围的绿色着染区域较大，随着修复时间的延长，见骨组织红染区域面积占测量区面积的百分数逐渐增大，表明成熟骨组织在逐渐增多，这与苏木精-伊红染色指标的结
果一致。

综上所述，Masson三色染色法，操作方法简单，普通脱钙骨切片即可。

在新生骨走向成熟过程中表现为红绿相间现象，新生骨质红染少，成熟骨内红染多，即骨质越成熟，红染越多。

Masson染色结合苏木精-伊红染色能较好判定新生骨走向成
熟骨的过程，但在判定骨质成熟度时Masson染色较苏木精-伊红染色更直观。

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基金声明：江苏省骨外科临床医学中心资助项目；国家自然科学基金资助项目(81171689)。

作者贡献：设计者为第一作者，实施者为第一、二、三作者，评估为全部作者，资料收集为第一、二、三作者，第一作者成文，第四、五作者审校，第一作者对文章负责。

利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：实验过程中对动物的处置应符合 2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

本文创新性：课题设计的主要创新之处在于比较Masson染色和苏木精伊红染色两种方法判定骨组织成熟度的敏感性，为评价组织工程骨修复骨缺损提供参考；本课题在设计中存在一定的缺陷：实验采用的修复材料为本课题组研制的丝素蛋白/羟基磷灰石/骨髓基质干细胞复合材料，其修复骨缺损与自体骨尚有差异。

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