载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤
载体构建目的基因克隆引物设计pcr质粒（载体）提取质粒选择提取步骤质粒与目的
基因双酶切选择内切酶摸索酶切条件（时间和温度）电泳检测及回收纯化步骤载体与目的
基因连接转化感受态细胞制备转化步骤阳性单克隆筛选上述转化得到的菌液接种到筛选培
养基中过夜培养挑菌并菌液pcr上述菌液pcr有结果的菌液送测，送测结果与预期相符则
该载体构建成功。

一、原理依赖于限制性核酸内切酶，dna连接酶和其他修饰酶的作用，
分别对目的基因和载体dna进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）
取两个装有液体培养基的3ml试管（视情况而定），向每根试管中加入40-100μL菌株，摇匀过夜。

2、提质粒（也就是载体）
按照质量增强颗粒试剂盒中的说明操作（根据情况在洗脱的最后一步再清洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）
反应所需试剂量（单位：UL）质粒所需内切酶10反应缓冲液2限制性内切酶1h2o7
所需
将加好的ep管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶
切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）
4.电泳检测
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收凝胶：使用琼脂糖和缓冲液逐个制备凝胶。

切割凝胶后，回收目标产物，并具有
纯化目标产物的功能；试验凝胶：琼脂糖和缓冲液按1:2的比例制备。

以测试目标波段是
否与预期一致。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯
化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的dna溶液纯化；产物纯化是将较纯的dna溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂
盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5.载体与靶基因的连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回
收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6.转化（连接产物转化为活性细胞）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7.单克隆检测
（1）挑单克隆
首先从冰箱中取出AMP，将其熔化，然后将3 ml加入含有LB液体介质μL AMP的3 ml试管中，与枪头充分混合；取5根1.5mlep管（可根据情况选择更多管），在上述培养基的每个支管中加入500μL，然后用接种环（或黄色枪头）拾取单克隆抗体，拾取后用枪吹；之后，摇动所选细菌4-5小时，直至其浑浊。

（2）单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行pcr，然后将pcr产物跑电泳，观察电
泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μl，加到3ml（有lb 液体培养液，amp+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlep管中送
测序，并保种。

注：① 在选择单克隆抗体时，我们必须选择单个圆形菌落，而不是带有卫星斑点的
菌落。

② 别忘了在介质中加入安培。

③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。

三、预防措施
1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；
3.连接反应是DNA重组过程中的关键步骤。

温度是决定其成败的重要参数之一。

因此，有必要控制结扎温度。

4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的
假阳性克隆背景。

针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（cip）去掉载体的5’-磷酸
以抑制dna片段的自身环化。