夹脊电针联合甲基强的松龙对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡表达的实验研究

夹脊电针联合甲基强的松龙对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋
亡表达的实验研究
李晓宁;梁雪松;迟蕾;刘双岭;臧召霞;李诺;梅继林
【摘要】目的:探讨夹脊电针联合甲基强的松龙治疗对大鼠急性脊髓损伤后受损组织的病理学改变及神经细胞凋亡表达的影响.方法:Wistar大鼠随机分为6组,用改良Allen's打击法制成脊髓损伤模型,分别进行HE和TUNEL染色,检测大鼠受损组织病理形态学的改变及神经细胞凋亡的表达.结果:HE染色显示,急性脊髓损伤组大鼠ld时出血明显,3d时神经细胞破坏最明显,7d时神经细胞凋亡有所减轻,14 d时凋亡已不明显,尤以夹脊电针联合甲基强的松龙组神经细胞保存较完好.TUNEL染色显示,与急性脊髓损伤组相比,术后3d、7d、14 d,急性脊髓损伤+夹脊电针组、急性脊髓损伤+甲基强的松龙组、急性脊髓损伤+夹脊电针治疗+甲基强的松龙组、急性脊髓损伤+抑制剂组神经细胞凋亡均减少(P＜0.05).术后7d、14 d,急性脊髓损伤+夹脊电针治疗+甲基强的松龙组神经细胞凋亡减少明显(P＜0.05).结论:急性脊髓损伤后7d、14 d时,夹脊电针联合甲基强的松龙可以抑制大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及神经细胞病理形态学异常改变.
【期刊名称】《中医药信息》
【年(卷),期】2017(034)001
【总页数】4页(P92-95)
【关键词】急性脊髓损伤;大鼠;夹脊电针;甲基强的松龙
【作者】李晓宁;梁雪松;迟蕾;刘双岭;臧召霞;李诺;梅继林
【作者单位】黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江哈尔滨150001;黑龙江中医
药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中
医药大学附属第二医院,黑龙江哈尔滨150001;黑龙江省医院,黑龙江哈尔滨150001;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔
滨150040
【正文语种】中文
【中图分类】R246
急性脊髓损伤(acute spinal injury，ASCI)是临床上的常见且严重的神经系统疾病，严重威胁着患者的健康和生命[1]。

目前国际通用的指南推荐中提到ASCI患者早期大剂量给予糖皮质激素是治疗本病的首选治疗方案，但因其副作用较大，常常伴有严重并发症，而未得到患者的广泛认可[2]。

随着近些年对急性脊髓损伤深入研究，夹脊电针作为一种传统的康复治疗手段，在临床应用和实践中取得了较好的疗效，本研究从时效性观察夹脊电针联合甲基强的松龙对大鼠急性脊髓损伤后受损组织的病理形态学改变及神经细胞凋亡的影响，探讨其治疗急性脊髓损伤的机理。

1.1 动物及分组
144只Wistar雌性大鼠，体质量(200±10)g，随机平均分为6组：假手术组(Sham组)、急性脊髓损伤组(ASCI组)、急性脊髓损伤+夹脊电针治疗组(EA组)、急性脊髓损伤+甲基强的松龙组(MP组)，及急性脊髓损伤+夹脊电针治疗+甲基强的松龙组(EA+MP组)，急性脊髓损伤+抑制剂组(MDL28170组)，每组再分为1天、3天、7天、14天四个亚组。

每个亚组为6只。

1.2 主要实验仪器设备
1.2.1 实验主要仪器见表1。

1.2.2 实验主要试剂及生产公司见表2。

1.2.3 主要配制试剂及其配制方法见表3。

1.3 造模方法
采用美国Impactor Model-Ⅲ spinal cord contusion system 打击器，计算机程控下精确打击制作大鼠 ASCI 模型(T10,中度损伤)。

用10%水合氯醛腹腔麻醉(3.5 ml/kg)，俯卧固定，选取后背正中切口，将大鼠固定于打击器基座上，打击棒以10 g×50 mm势能撞击以T10为中心段脊髓，造成该段的急性脊髓中度损伤，生理盐水冲洗伤口及清除残留血液，伤口部位常规分层缝合，选择BBB评分在1～3分入组。

1.4 治疗方法
Sham组：手术后常规饲养，正常捆绑，其余不予任何处置。

ASCI组：模型制备成功后单笼饲养，正常捆绑，其余不予任何处置。

EA组：于模型制备成功后3 h进行夹脊电针早期干预治疗，此后每日1次，直至疗程结束。

针刺穴位选取T9、T11节段夹脊穴。

将0.35 mm×13 mm毫针直刺入所选穴位下4～5 mm，给予电针仪脉冲连续波，脉冲宽度：(0.5±0.15)ms，频率为100 Hz，脉冲峰值为Vp1≥(40±10) V(在500 Ω负载下)，刺激时长为30 min/次/日。

MP组：术后30 min时，给予实验大鼠一次性注射甲基强的松龙。

甲基强的松龙按30 mg/kg，与0.9 g/L生理盐水配置成0.5 ml注射液，给予大鼠腹腔注射；正常捆绑，其余不予任何处置。

EA+MP组：夹脊电针治疗方法同上，治疗次数同上；甲基强的松龙用法与治法同上。

正常捆绑，其余不予任何处置。

MDL28170组：术后30 min腹腔注射MDL 28170(1 mg/kg)，此后每天同一时间点分别注射，直到疗程结束。

正常捆绑，其余不予任何处置。

1.5 取材
大鼠在实验治疗结束后，依照相对应打击损伤时间进行麻醉，然后断头处死，于冰盒上快速取出损伤处脊髓，长度约4 cm，从损伤中心处迅速切开，置入4%多聚
甲醛缓冲液中固定后4℃冰箱待测。

1.6 观察指标
组织病理学形态变化：经切片脱蜡至水、染色、脱水、透明、封片、镜检等步骤进行HE染色并镜下观察。

神经细胞凋亡：经透化、PBS漂洗、封闭、Labeling、苏木素复染、脱水、透明、封片镜检等步骤观察神经细胞凋亡。

1.7 统计学处理
利用SPSS19.0对数据进行统计学处理。

所有计数资料均用表示,先进行方差齐性
检验。

组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多个样本均数之间的多重分析行LSD-t检验
2.1 HE染色观察脊髓组织病理学形态变化
ASCI组大鼠1 d时出血明显，可见大量凋亡神经细胞；3 d时细胞破坏最明显，
可见大量凋亡神经细胞，核仁消失，核固缩；7 d时神经细胞凋亡有所减轻，神经细胞坏死，正常神经细胞数量减少，胶质细胞增生，炎性细胞浸润；14 d时凋亡
已不明显，可见空泡存在，其余4治疗组神经细胞损伤情况较ASCI组明显减轻，尤以EA+MP组神经细胞保存较完好。

2.2 TUNEL法检测脊髓组织神经细胞凋亡
TUNEL检测可见，Sham组未见明显神经细胞凋亡，与EA组、MP组、EA+MP 组、MDL28170组相比，具有显著差异(P<0.05)。

与ASCI组相比，术后3 d、7 d、14 d，EA组、MP组、EA+MP组、MDL28170组神经细胞凋亡减少，差异
显著(P<0.05)。

与EA组、MP组、MDL28170组比较，术后7 d、14 d，
EA+MP组神经细胞凋亡减少，差异显著(P<0.05)，详见表1。

急性脊髓损伤严重影响患者生活质量，其致残率和死亡率极高。

现代医学认为继发性损伤是导致急性脊髓损伤肢体功能障碍的主要原因之一，其机制包括血管痉挛、血栓形成、微循环障碍、水肿、自由基形成、兴奋性氨基酸生成等[3]。

近年研究
证实神经细胞凋亡导致神经元大量丢失是引发急性脊髓继发性损伤的重要病理机制。

他通过两个阶段发挥作用：初始阶段，凋亡伴随着坏死发生；晚期阶段，则主要局限于白质中包括少突胶质细胞[4]，受损细胞微环境发生变化，影响各种促进凋亡
和抑制凋亡的因子的表达[5]。

甲基强的松龙是目前治疗脊髓损伤的常用药物，近
年来国内外对其治疗ASCI作用机制进行了广泛的研究，研究表明甲基强的松龙具有多方面的神经保护作用，包括改善微循环、抑制脂质过氧化、减少细胞钙内流、维持神经元兴奋性等[6-8]。

张强，廖维宏等[9]利用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记法及免疫组化SP法观察大剂量应用甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤区细胞凋亡的影响，发现早期应用大量甲基强的松龙不仅减轻大鼠脊髓损伤后脊髓水肿、微环境改变，而且可以阻止或减轻脊髓神经细胞凋亡。

中医学认为急性脊髓损伤的病机为督脉受损，导致与其及相关联的经络、脏腑功能紊乱，病位主要与督脉、肾经有关[10]。

夹脊电针是中医治疗急性脊髓损伤的重要手段，夹脊穴循行于脊柱，内夹督脉，外循膀胱，其下为脊神经后支及静脉分布，电刺激可直接作用于脊髓及包膜，形成电场可改善损伤区微环境，促进脊髓纤维再生。

王振宇,孙忠人等[11-12]通过动物实验观察电针夹脊穴对脊髓损伤大鼠皮层体感诱发电位的影响及其对神经功能恢复的促进作用，发现电针夹脊穴对脊髓损伤大鼠神经功能恢复起促进作用，先期电针干预的效果好于后期。

李晓宁等[13]观察夹脊电针对大鼠脊髓继发性损伤后c-fos mRNA及BNIP3 mRNA表达及其变化规
律的实验中证实了夹脊电针能促进脊髓损伤后功能的恢复及抑制神经细胞凋亡。

本实验通过建立ASCI大鼠模型，应用MP及MDL28170作为阳性对照药物，对比
分析夹脊电针与MP、MDL28170对ASCI大鼠神经细胞凋亡的影响，证实了在
急性脊髓损伤后7 d、14 d时，EA+MP可以抑制大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及神经细胞病理形态学异常改变，在治疗ASCI上优于两者单独治疗，为临床治疗急性脊髓损伤患者提供新思路。

【相关文献】
[1] Lu J,Ashwellk Waite P.Advence insecondary spinal cord injury role of
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[2] Stevens RD,Bhardwaj A,K irsh JR,et al.Critical care and perioperative management in traumatic spinal cord injury[J].Journal of Neurosurgical Anesthesiology,2003,15(3):215-229.
[3] Rink A，Fung KM，Trojanowski JQ，et al.Evidences of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injure in the rat[J].Am J Pathol,1995,147:1575-1583.
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[6] Madsen JR,Macdonald P,Irwin N,et al.Tacrolimus(FK506) increases neuronal expression of GAP-43 and improves functional recovery after spinal cord injury in rats[J].Exp Neurol, 1998,154:673-683.
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[9] 张强,吴越,廖维宏,等.大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后的神经细胞凋亡的影响[J].中华创伤杂志,2001,17(2):89-92.
[10] 尹洪娜，孙忠人，李全.电针夹脊穴对脊髓损伤大鼠内质网应激相关因子CHOP影响的实验研究[J].中医药信息，2016,33(4):35-38.
[11] 王振宇,孙忠人,刘睿姝.电针夹脊穴对脊髓损伤大鼠皮层体感诱发电位的影响[J].中国康复理论与实践,2009,15(10):938-941.
[12] 尹洪娜，孙忠人，李全.电针夹脊穴对脊髓损伤大鼠内质网应激相关因子Caspase-12影响的实验研究[J].中医药学报，2016,44(3):33-36.
[13] 李晓宁,张良,杨庆红,等.夹脊电针对脊髓损伤大鼠c-fosmRNA及BNIP3 mRNA表达影响的实验研究[J].针灸临床杂志,2015,31(7):83-86.。