聚乙二醇对超氧化物歧化酶修饰技术及产物研究

1.1 PEG 化概述
1.1.1 PEG 分类
PEG 是具有良好生物相容性的高分子聚合物(分子量几百到几万)， 也是经 FDA 批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。分子式如下[4]： CH2O)n CH2 CH2OH PEG 修饰(PEG modification)，或称 PEG 化(PEGylation)是二十世纪 70 年代后 期逐渐发展起来的一项热门技术，目前已用于多种蛋白质药物或非蛋白质药物的 修饰，如腺苷脱氨酶、α -干扰素、葡萄糖脑苷脂酶和血红蛋白等[5]。PEG 用来制备 治疗用蛋白质产品是指蛋白质上至少附着有一个 PEG 分子。 PEG 化原理是将 PEG 末端羟基转化成高反应活性基团，与蛋白质的巯基、氨基、羧基或是羟基进行偶 联反应，生成 PEG-蛋白质偶联物。 根据偶联基团的不同，目前常用修饰氨基的活化剂分为两类：烷基化 PEG 和 酰基化 PEG。烷基化 PEG 包括 PEG-醛、PEG-三氟乙磺酸、PEG-环氧化物等[6]。
I
重庆大学硕士学位论文
中文摘要
蛋白质氨基修饰率为 62.1%， 应用 SOD 分子表面可及性数据对 PEG 可能的修饰位 点进行了预测。 关键词：聚乙二醇，化学修饰，超氧化物歧化酶，分离纯化
IICT
In this article, a method was established, which can isolate crude SOD simply, quickly and effectively. Then two PEGs, PEG-ALD and SS-PEG, are compared on their modification results of SOD with different reaction conditions. Meanwhile, the optimized reaction condition of SS-PEG modification was acquired. At last, we investigated the stability of PEG-SOD by experiments of heat, acid, alkaliand and proteinase. The detailed contents of research were described as the following: 1 Purification of crude SOD A new approach of isolating crude Superoxide Dismutase (SOD), was established by anion exchange chromatography. In this way, using the Q XL column of anion exchange chromatography, 300mg of crude SOD was isolated to 98.8mg pure SOD after dialyzation and freeze-drying in about 1h. The purified protein appears as a single band on the SDS-PAGE electrophoretogram, whose position is similar to that of standard SOD. The activity experiment showed the enzymatic activity improved from 1774.812NU/mg to 4294.76NU/mg, with a recovery of 79.7%. 2 Pegylation of SOD PEG-ALD and SS-PEG were selected for the SOD modification. These two reagents were compared with each other on their modification results of SOD with different reaction conditions. With different reaction temperature, or the molar ratio of SS-PEG to SOD, degrees of modification of SOD with SS-PEG are all changed. Reaction conditions of preparation of SS-PEG-SOD conjugation were investigated (reaction time 0.5h, pH7.4, 4℃, the mole ratio of PEG: SOD is 12:1). Under these conditions the enzyme activity of PEG-SOD is 89.3%. 3 Purification, identification and property study of PEG-SOD The mixture of SS-PEG-SOD conjugate was isolated by Sephadex G100 gel filtration column. The conjugate solution was eluted with 0.02M phosphate buffer and the flow speed is 0.5ml/min. The protein peaks were detected at 280nm. Purified PEG-SOD was identified with SDS-PAGE and the modified ratio of SOD was determined according to a TNBS method. The possible modification sites of amino residues were prognosticated by using accessibility data. The activity and stability of PEG-SOD were also detected. Compare native bovine SOD with PEG-SOD in stability by experiments of heat, acid, alkaliand and proteinase. The stability of PEG-SOD
重庆大学 硕士学位论文 聚乙二醇对超氧化物歧化酶修饰技术及产物研究 姓名：廉洁 申请学位级别：硕士 专业：药物化学 指导教师：王伯初 20060501
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中文摘要
摘
要
本文建立了一种简单、快速、有效的超氧化物歧化酶分离方法，评价了两种 聚乙二醇(PEG)对纯化 SOD 的修饰效果，优化 SS-PEG 修饰 SOD 反应条件，纯化 修饰酶并对其进行性质研究，通过抗热、抗酸碱、抗酶解实验研究不同条件对 PEG-SOD 活性的影响， 修饰 SOD 与修饰前相比， 其稳定性大大提高， 为 PEG-SOD 的申报新药及药用研究开发提供技术支持和理论依据，对其它药用蛋白的 PEG 化 亦有很大的参考价值，也对蛋白质药物的开发应用提供一种新途径。具体研究内 容如下： 一：SOD 纯化研究 建立了用 Q XL 阴离子交换层析柱纯化牛 Cu, Zn-SOD 粗酶的方法。将 SOD 粗酶经 pH7.4 的 PB 溶解，在 Q XL 柱上以 PB+ NaCl 为流动相进行梯度洗脱。在 检测波长 280nm 处获得蛋白峰，SEC-HPLC 图谱中，透过液的出峰时间与 SOD 主 峰一致， 经 SDS-PAGE 电泳和活力测定表明透过峰蛋白质具有 SOD 相同分子量及 较高酶活力， 证实透过峰即为目的峰。 收集透过峰， 经透析、 冷冻干燥后所得 SOD 的纯度为 85%。而酶活力由原来的 1774.812NU/mg，提高到 4294.76NU/mg，总的 酶活损失较小，活性回收率达 79.7%。 二：聚乙二醇修饰 SOD 反应条件研究 选择两种 PEG 作为修饰剂，一种是 PEG-醛(ALD-PEG)，另一种为 PEG-琥珀 酸琥珀酰亚胺酯(SS-PEG)。对 SS-PEG 修饰 SOD 的反应条件进行了考察，评判标 准是 SDS-PAGE 电泳图中修饰产物均一性及酶剩余活性的大小。其中在 SS-PEG 与 SOD 摩尔比为 12:1，反应温度为 4℃，pH 为 7.4，反应时间半小时的条件下， 获得修饰产物剩余酶活较高为 89.3%，修饰产物专一。 三：聚乙二醇修饰酶的分离纯化、鉴定及其性质研究 根据修饰产物之间分子量的差别， 利用 Sephadex G100 凝胶过滤层析对反应液 进行分离纯化， 获得了电泳纯的 PEG-SOD， 并对其采用 SDS-PAGE 电泳进行鉴定， 初步证实了分子量。 本文对 PEG-SOD 修饰酶在抗热、抗酸碱、抗酶解能力方面进行了研究，并测 定了修饰酶的剩余酶活力及氨基修饰率。结果表明：PEG 修饰 SOD 在抗热能力方 面与天然酶相比明显增强，在 80℃保温 0.5h，修饰酶残余活力为 90%，而天然酶 是 63%；修饰酶与天然酶在抗酸碱能力方面也明显不同，修饰酶抗酸能力强，在 pH2.0 时活力为 78%， 而天然酶为 22%； 修饰酶在抗胃蛋白酶解方面也有了较大提 高。这些结果暗示，在不同环境下，修饰酶较天然酶能更好地保持酶活力。测得
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重庆大学硕士学位论文
1绪
论
1 绪 论
近年来随着基因工程技术的发展，用于疾病治疗的多肽、酶、细胞因子等蛋 白质药物越来越多地被研究开发，重组蛋白质的可用性也导致了蛋白质应用方面 的发展。这类药物具有专一性强、时效高等优点，但也有许多迫切需要解决的问 题，如大多数蛋白质或多肽具有抗原性及免疫原性，容易被机体快速消除；不稳 定，易被酶水解等。而化学修饰的目的之一就是保护蛋白质，修饰基团可有效地 阻止蛋白水解酶与蛋白质骨架本身的接触，从而阻止蛋白质的降解。其它优势还 包括：在特定环境条件下，增加治疗蛋白质的稳定性及循环时间并且减小其免疫 原性等[1]。1984 年 Mozhaev 等提出：蛋白质球体的非极性表面原子簇与水接触可 使得酶不稳定，随后建议，通过化学修饰，使蛋白球体表面亲水化即可实现酶的 稳定化， 并用 α -胰凝乳蛋白酶作为模型酶证实了这一想法[2]。 修饰剂之一的聚乙二 醇(PEG)具有完全的生物相容性及亲水性，没有抗原性及免疫原性，长期实验也表 明其没有毒性。而且 PEG 与蛋白质的偶联物也具有这些性质，偶联后 PEG 亲水性 长链还对生物大分子具有排斥作用，利用这一性质，PEG 修饰可以广泛应用于降 低蛋白质之间由于生物识别现象引起的免疫原性，还能保护蛋白避免受到免疫系 统的吞噬和其他蛋白的水解[3]。另外 PEG 修饰的腺苷脱氨酶、L-门冬酰胺酶等已 在美国研制成功， 投入临床应用， 所以 PEG 作为蛋白质修饰剂的安全性是可靠的。 因此对蛋白质进行 PEG 化修饰，由于修饰产物其独特的物理化学性质及生物学功 能，从而成为化学修饰法中较为成功的一种方法。
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英文摘要
increased significantly in heat, acid, alkali and enzymolysis. These results suggested PEG-modified SOD may be more suitable for therapeutic use. Keywords: SS-PEG, chemical modification, SOD, separation, purification