一株野生大型真菌的分类学鉴定及其培养特性与营养成份研究

一株野生大型真菌的分类学鉴定及其培养特性与营养成份研究
福建农林大学
硕士学位论文
一株野生大型真菌的分类学鉴定及其培养特性与营养成份研究
姓名：李晶
申请学位级别：硕士
专业：微生物学
指导教师：林占
20100601
一株野生大型真菌的分类学鉴定及其培养特性与营养成分研究摘要：通过传统与现代分子生物学结合的方法，对在福州金山采集的野生大型真菌进行分类学鉴定，从而探讨提高大型真菌鉴定准确度和精确度的方法。

同时，确定其属性，对其生长条件、主要营养成分等进行研究，开发其商业价值。

方法：通过观察比较其孢子，菌丝，单菌落以及子实体形态；并与现代的分子生物学方法相结合对其分类学进行鉴定。

现代分子生物学的步骤：先对该菌株的ITS序列（internal transcribed spacer）进行扩增和测序，然后将所得结果在EMBL上的进行比对分析，最后结合采用Clustal X1.83，Mega 4.0等软件对该真菌的ITS序列进行系统发育分析。

结果：（1）供试菌株菌丝有隔膜，并有锁状联合现象；（2）供试菌株ITS序列长度为565bp；（3）从系统发育树图谱中可以看出，供试菌株和巨大口蘑（Tricholoma giganteum）（登陆号EU051917）同源性最高，说明这2个菌种的亲缘关系最近；（4）初步鉴定该野生大型真菌属无隔担子菌亚纲（Homobasidiomycetidae），伞菌目（Agaricales），口蘑科（Tricholomataceae），口蘑属（Tricholoma），暂命名为金山巨菇（Tricholoma jinshanense）；（5）大型真菌的形态特征结合ITS序列分析可以作为大型真菌分类鉴定的依据。

然后对该菌株进行培养特性方面的研究，结果表明影响菌丝生长的主要因素依次是培养温度，培养基氮源，培养基pH值和培养基碳源，结果培养温度为25℃，氮
源为酵母，碳源为蔗糖，pH值为7.0时候为最佳生长条件。

最后经测定菌草栽培的大型真菌子实体的含水量为83.66%，其它主要营养成分粗多糖，粗蛋白，粗脂肪以及各种氨基酸的含量分别为33.15%，28.41%，4.23%，13.97%。

关键词：野生大型真菌菌草技术ITS序列子实体形态培养特性营养成分
A wild macrofungi in taxonomy identification and the study on culture
characteristics and nutrition
Abstract：Identify a species of wild macrofungi which was found in the Jinshan area of Fujian Agriculture and Forestry University, discussing a better method of microbiology identification. Method: Using the traditional identification methods from the morphology of spore, single colony, hyphal and fruit body; Using the methods of molecular biology to amplify and sequence the strains of ITS（Internal Transcri bed Spacer）sequence, then BLAST it in EMBL, and construct the Phylogenetic tree of the ITS sequence with Clustal X1.83 Mega 4.0. Result: （1）Obviously there is septum in mycelium of the subject, and clamp connection can be seen easily. （2）The length of ITS sequence of the subject is 565bp. （3） It can be seen from Phylogenetic Tree that the subject and Tricholoma giganteum homology is very high, so these two species are both Tricholoma.（4）Preliminary identified the wild unknown strains belong to Homobasidiomycetidae Agaricales Tricholomataceae Tricholoma. We call it Tricholoma jinshanense temporary. （5）The morphological characteristics of large fungi with ITS sequence analysis can be used in the macrofungi classification and identification. Using orthogonal design L16 （44）were applied to research the best culture conditions of Tricholoma sp
mycelia,including the best source of carbon、the best source of nitrogen,the optimum temperature and the optimum pH．The experiment results indicated that the optimum C –source for its mycelia growth was sucrose and the optimum N–source was yeast；The optimum temperature was 25 ℃；The optimum pH was 7.0．And the fruit body of Tricholoma sp on the contain of moisture, Polysaccharide, protein, fat and Amino are 83.66%, 33.15%, 28.41%, 4.23% and 13.97%.
Key words：wild macrofungi JUNCAO Technology its sequence biological characteristics morphological character nutrition
独创性声明
本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。

尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。

与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。

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□
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指导教师亲笔签名：日期：
１前言
食（药）用菌产业有着悠久的历史，大型真菌几乎随处可见，已发现的长在木头上的蘑菇估计已有大约3亿年的历史。

食（药）用菌不仅营养丰富，味道鲜美，自古以来就被人们列为菜中佳肴，并有“山珍海味、猴头燕窝”之美称，还含有高蛋白、低脂肪、维生素和微量元素、多种人体必需氨基酸及抗生素、核苷酸、多糖等物质，既能促进人体新陈代谢，增强体质，又能防止人体疾病的侵入，从而被营养学家和医药学家誉为“健康佳品，保健食品”。

有些发达国家还提出了“菌食论”，采用食（药）用菌为主进行以食代疗的保健方式。

我国食（药）用菌资源非常丰富，据张树庭等[1]报道，我国大约有1500-2000种食（药）用菌，其中981种已经被确认，截至2002年，已有92种驯化成功，其中约50种已进行商业化栽培，它们分别隶属于１４４个属、４６个科。

主要包括子囊菌亚门的２个纲，３个目，６个科，７个属；担子菌亚门的２个纲，７个目，２５个科，６０个属，是世界人工栽培的食（药）用菌种类最多的国家，其中平菇、木耳、香菇、双孢蘑菇、金针菇等的产量均居世界首位［２］。

我国的食（药）用菌产业是现代农业中迅速崛起的一个新兴产业。

我国作为食（药）用菌生产大国，食（药）用菌产业在世界上已起到了举足轻重的作用。

据中国食用菌协会统计，２００６年全国食（药）用菌总产量（鲜量）达１４７４．１万吨，占全球总量７０％以上，比２０００年增长１２２．１％；总产值达５８５．５亿元，在种植业中仅次于粮、棉、油、果、菜，居第６位［３］。

全国食（药）用菌从业人员达２０００多万，食（药）用菌主产县５００个以上，产值超亿元以上的县就有１００多个。

食（药）用菌产业在有的地区该产业产值已占农业总产值的一半并已成为部分农业县的支柱产业，是当地财政收入，提高就业率的主要来源之一，是增加农民收入，提高就业率的一条主要途径[4]。

同时，食（药）用菌还是我国重要的出口创汇农产品。

据国家海关统计，２００７年全国食（药）用菌出口创汇１４．２４亿美元，比２００６年增加３．２３亿美元，同比增长２６．９％，出口量占全球食（药）用菌总出口量的４０％以上。

食
（药）用菌栽培不仅能使废料化害为利，兴菌成业，变废为宝，而且还能建立一个多层次的生态农业系统。

有资料显示，在食（药）用菌和纤维素酶的共同协同作用下对废料中难降解的纤维素、半纤维素、木质素等，可顺利地将其分解成葡萄糖，自然地起到降解作用，并能将氮源迅速地转化成蛋白质，碳源转化为碳水化合物，使有机物进入食物链，加入生物循环系统。

这些都将单纯的植物——动物的二维农业向植物——动物——菌物的三维农业转变，对生态农业具有极大的实用经济价值。

食（药）用菌产业在我国现阶段已发展成为振兴农村经济、富民强县的一个重要支柱产业，许多农民通过栽培食（药）用菌摆脱了贫困，走向了富裕。

食（药）用菌产业我国的农业增效、农民增收、全面建设小康社会、构建和谐社会及推进社会主义新农村建设发挥了重要作用［５］。

全世界虽然已有近千个食（药）用菌品种被确定，但仍有许多未知的种类有待人们去发现。

近年来，由于大部分野生菌都不能进行人工栽培、营养丰富、药用价值显著吸引了许多生产者，野生菌经济正在逐步增长。

作为食（药）用菌产品出口大国，新品种的发现和开发，给我们带来了良好的经济效益，但也给许多地区带来了品种权的争夺问题。

现代的微生物分类学，已经从原来的按微生物形态特征来进行分类的经典分类学发展到按照它们的亲缘关系和进化规律来进行分类的微生物学系统学阶段。

分类学３个基本阶段包括分类、鉴定及命名。

具体来说，分类解决的是从个别到一般或从具体到抽象的问题，也就是通过收集大量与个体描述相关的文献资料，再经过科学的归纳和理性的思考，从而整理形成一个科学的分类系统。

鉴定与分类则是恰恰相反，它是从一般到特殊或从抽象到具体的过程，是通过详细观察和描述一个未知名称的纯种微生物的各种性状及特征，然后再通过查找现有的分类系统，从而解决其分类地位及属种名称。

命名则是为一个新发现的微生物确立一个新学名，当你详细观察和描述某一具体菌种后，再认真查找现有的权威性分类鉴定手册，如果发现这是一个以往从未有人记载过的新种，你就得按微生物的国际命名规则给予它一个
新的学名。

综上所述，分类并不是一项简单的工作，它是一项专业性工作，鉴定则是一项战略性工作，而命名却是一项开拓性的创新工作。

食（药）用菌的分类是人类认识进而利用和改造食（药）用菌的一种重要手段，我们只有在充分掌握分类学知识的基础上，才能对繁杂的食（药）用菌类群有一清晰的认识，从而了解其亲缘关系与演化关系，并为人类开发利用食（药）用菌资源提供可靠的依据。

传统的食（药）用菌分类主要是以其形态结构、细胞、生理生化、生态学、遗传等特征为依据，特别是以子实体的形态及孢子的显微结构为主要依据。

现代的微生物分类中已经从不同层次（细胞的、分子的），采用不
同学科（物理学、化学、遗传学、分子生物学、免疫学等）的技术方法来研究不同微生物的细胞、细胞组分及代谢产物，从中挖掘出能够反映微生物类群特征的资料。

因此，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都具有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。

食（药）用菌常见的形态学特征包括：菌丝体形态、颜色、结构，单孢子形态、结构，及子实体形状、构造等等。

这些形态学特征可作为分类和鉴定的重要依据之一，主要是因为：首先，它们易于观察和比较，尤其是一些具有特殊形态结构的食（药）用菌；其次，许多形态学特征都是依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性。

微生物的酶和调节蛋白质活性的本质与它们的生理生化特征是直接相关的，而酶及蛋白质都是基因产物，所以，对微生物生理生化特征的比较也就是对微生物基因组的间接比较，由于测定生理生化特征比直接分析基因组要容易操作得多，因此生理生化特征在微生物的系统分类上的意义仍然是不可忽视的。

微生物常用于分类鉴定的生理生化特征主要有：对温度的适应性、对pH的适应性、营养类型、对渗透压的适应性及与氧的关系和代谢产物等。

不同的食（药）用菌对温度、pH的适应性各不相同，各种酶（如酯酶同工酶、漆酶、淀粉酶等）的活性也各有差异，酯酶同工酶在食（药）用菌的个体内具有较高的相对稳定性，是食（药）用菌种质资源研究中最有效的生化指标之一，酶谱资料还可作为物种鉴定、
分类研究、进化与变异的重要指标［６］。

国际上按照植物新品种保护联盟（UPOV）规定，新品种保护以相关的新品种DUS测试指南为鉴定依据。

但由于食（药）用菌形态分化的多样性远不及绿色植物，为了鉴定的方便，达到有效的保护，发达国家多将食（药）用菌品种列入专利法进行保护。

日本作为食（药）用菌发展较早，较大的国家之一，在1981年加入1978年版UPOV条约，并制定了14种食（药）用菌新品种DUS测试指南，概括起来主要鉴定内容在形态特征、生理特征、栽培特性、商品特性和遗传特征5个方面[4]。

而欧美发达国家的食（药）用菌品种采用专利法或专门法或多轨保护，专利法保护则是欧美发达国家通用的必不可少的基本制度。

如意大利和匈牙利采用专利法和专门法共同进行保护；法国，丹麦以专利法来保护；美国则由农业部植物
品种保护办公室负责审查并颁发植物品种保护证书，同时采用植物专利，普通专利，品种保护证书三种方式的“多规制”全面保护。

在加入WTO以前，我国食（药）用菌研究者和生产经营者对品种权及其保护意识薄弱，菌种随意冠名，同物异名严重，造成菌种严重混乱，同时品种权保护技术研究处于空白，新品种无从保护。

食（药）用菌品种鉴定技术：是对商业栽培品种进行鉴定和保护，主要针对育种者投入了智慧和劳动，花费了巨额的资金才获得经济性状优良的品种，其目的在于保护育种者权利，维护社会的公正，只是在菌种命名的工作上，我国还需要进一步努力。

在我国，目前大型真菌传统的分类依据主要是以形态观察为主，子实体宏观形态主要包括新鲜标本菌盖、菌柄、菌褶、菌肉的形状、大小、颜色、气味、质地等的观察；微观形态观察主要包括子实体的担孢子、担子、缘囊体、侧囊体、菌盖及菌柄表皮菌丝的形态，菌盖表皮囊状体的有无和形态的观察。

但大型真菌的形态特征复杂，而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而变化，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不稳定或意见分歧。

传统的伞菌类大型真菌的分类研究也不断多样化，不再仅仅局限于形态分类方法[8]。

随着生物化学、遗传学、分子生物学等学科的发展，应真菌分类学自身发展的客观要求，为使得真菌分类研究变得操作简便、准确和可靠，因此，在真菌的现代分类学中引入了分子生物学技术的鉴定方法，这样一来真菌分类学在分类方法和分类系统等方面都发生了巨大的变化[9]。

１．１食（药）用菌品种鉴定技术
随着分子生物学的发展，多种在分子水平上研究生命现象的技术与方法都已建立，特别是利用分子标记去研究生物的基因定位与克隆、遗传变异、系统进化等已成为近年来的研究热点。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平中遗传变异的直接反映。

由于分子标记与以往的遗传标记相比有着许多优越性，因此它们在真菌的亲本鉴定、基因分离与克隆、遗传变异、菌株及杂合子鉴定和植
物系统[10]等方面已得到了广泛的应用。

目前己经开发了几十种基于DNA序列多态性的分子标记，如RFLP、RAPD、AFLP、SSLP、STS、VNTR、SCAR、CAPS、ITS序列分析等，其中以RFLP、RAPD、AFLP、SSR和rDNA（ITS序列分析）标记
较为广泛地应用于各种不同真菌的遗传分类，菌种鉴定，制定分类标准等研究中[11]，然后将分析结果构建系统发育树来进一步了解菌株在分类学中的地位[12]。

以下详细介绍比较常用的几种分子鉴定方法：
１．１．１ＲＦＬＰ标记
RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism），即限制性片段长度多态性，它是Bostein在1980年首先提出[13]，是最早发展的分子标记技术。

原理是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成特定DNA片段的大小。

基本步骤：提取DNA，用限制性内切酶酶切DNA，用凝胶分开DNA片段，把特定DNA转移到滤膜上，利用放射性标记的探针显示特定的DNA片（通过southern杂交）并分析结果。

通过RFLP分析可对食（药）用菌进行种间亲缘关系及系统进化的研究，此外，也可对食（药）用菌品种、菌株乃至体细胞进行鉴定。

李英波等[14]研究了32个野生和人工栽培香菇（Lentinusedodes）菌株的RFLP，他们首先以质粒BluescriptM13——（PBS）为载体构建了香菇的部分基因文库，用从文库中筛选出的3个随机DNA克隆和1个蜜环菌中的rDNA克隆作为RFLP探针，其中2个随机DNA克隆和1个rDNA克隆可检测到32个香菇菌株特有的限制性片段长度多态性，揭示了32个香菇菌株之间的遗传分离。

结果表明，香菇的遗传分离普遍存在于菌株间而与地理位置没有相关性，并将23个菌株分成4组，另外的9个菌株独立存在。

陈春涛等[15]利用PCR技术扩增了10个香菇主栽品种的核糖体DNA（rDNA5.8）+ITS区段及线粒体DNA （mtDNA）的小区段，分析了这些片段的RFLP图谱，结果显示，菌株间的rDNA在5.8sITS区段差异很小，表明同一菌种间的rDNA具有相对的遗传稳定性；不同菌株间未检出mtDNA的差异，表明菌株间在所研究的区段具有很高的遗传相似性。

从理论上讲，任何可识别的基因均可定位在RFLP图谱上，这些定位的基因都可以从与其紧密连锁的分子标记出发进行克隆。

利用RFLP 作为分子标记构建食（药）用菌高密度的基因组遗传连锁图谱，如果一旦获得了与目的基因紧密连锁的RFLP标记，就可以通过染色体定位等途径从克隆的RFLP得到目的基因。

利用RFLP标记也可对食（药）用菌的数量性状基因进行分析和定位。

在食（药）用菌的遗传育种工作中，还可利用紧密连锁的RFLP标记去示踪性状基因，并使用RFLP 图谱，直接筛选到那些在目的基因附近发生了重组的个体，从而可提高选择的效
率[16]。

但是，RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很大的空间区[17]，与RFLP相比，RAPD技术比较便宜，方便易行，非常灵敏，模板DNA 用量少，而且不需要同位素，安全性好。

继RFLP之后，RAPD是应用较广泛的，特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面[18]。

１．１．２ＲＡＰＤ标记
RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA），此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有
10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。

由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR，单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。

引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

与RFLP、AFLP、微卫星标记相比，RAPD标记具有操作简单、不需要放射性元素、DNA需要量极少、无需知道DNA的序列信息、技术成本低、具有极大的丰富性，能反映整个基因组的变化；具有极大的探测性，无需合成特定序列引物；还具有高效性与灵敏性，可在短期内获得大量多态DNA片段，只要遗传特异性发生变化，即使亲缘关系非常近的个体也能识别的优点，因而它在食（药）用菌研究中被广泛应用[19]。

覃琦[20]利用RAPD技术对香菇非对称杂交的亲本与后代之间的遗传相关性进行了分析，结果表明非对称杂交后代的遗传距离与单核受体较近而与双核供体遗传距离较远。

阎培生等[21]利用RAPD 技术对木耳属不同种和种内不同菌株进行了分子鉴定，结果表明RAPD技术可有效地用于木耳属种或菌株的快速准确鉴定。

利用RAPD分子标记技术选择亲本可克服传统方法的缺点，利用分子标记所揭示的多态性通过各种数量分析的方法计算相似系数，进行聚类和排序分析，确立供试菌株的亲缘关系或进行种内遗传多样性研究。

但是该技术的缺点主要是一种显性标记而不能区分杂合体和纯合体，结果的重复性易受多因素的影响[22]。

１．１．３ＡＦＬＰ标记
AFLP（Amplified fragment Length Polymorphism）即扩增片段长度多态性，是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法，特点
是把RFLP和PCR结合起来，基本步骤是：先把基因组DNA用限制性内切酶进行酶切，在得到的限制性片段两端加上带有特定序列的接头，用与接头序列互补的但3`端有几个随机选择的核苷酸的引物进
行特异PCR扩增，只有那些与3`端严格配对的片段才能得到扩增，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分开这些扩增产物并检测[23]。

DUIM等[24]用AFLP对69株标准株和19株临床株弯曲杆菌进行鉴别和亚型分型，发现AFLP是对弯曲杆菌种、亚种以及菌株水平进行鉴别的一个有用工具，是一种行之有效的鉴别弯曲杆菌的基因指纹图谱技术。

香菇是我国第二大食（药）用菌类，贾建航等[25]首次将AFLP对香菇菌株Cr04DZ（经空间诱变突变体）与其地面对照菌株Cr04进行了DNA指纹分析，找出了它们之间的DNA遗传多态性，从分子水平上证实了香菇经空间诱变后遗传物质发生了变化，为食（药）用菌的空间变异提供了分子生物学上的基础。

１．１．４ＳＳＲ标记
SSR（Simple Sequence Repeat）标记，即微卫星DNA （microsatellite DNA），
亦称简单序列重复，是由2～6个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段，为共显性[26]，均匀地分布在整个真核生物基因组中，有保守的DNA序列。

首先获得SSR序列，由于微卫星两侧的序列在同一物种间是高度保守的，即可据此设计引物，然后进行PCR扩增[27]。

在扩增时加入含有放射性标记的dNTP，将扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过放射自显影显示出结果。

这一方法灵敏度高，谱带清晰。

SSR两翼具有相对保守的单拷贝序列，根据该序列设计引物，对模板DNA进行PCR扩增，所检测到的扩增片段的长度多态性可作为分子标记。

与其它分子标记相比，SSR标记具有数量丰富、多态性高、共显性遗传、DNA用量少、操作简便、重复性好等优点，在发展高密度遗传图、植物品种鉴定、基因定位、群体遗传、物种进化等研究中广为应用[25-30]。

开发SSR标记的方法主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等四种[31]，其中数据库搜索法，尤其是从表达序列标签EST（expressed sequence tags）数据库中搜索，由于具有省时、省力、低成本等优点，已经成为一种广为采用的方法[32-34]。

研究表明SSR位点的等位基因数目比其它分子标记揭示的等位基因数目多，同时因其使用程度简单、快速、重复性好，被认为是一种理想的分子标记方法[35]。

但作为第二代分子标记[36]方法，SSR标记在病原菌中的应用较多[37-39]，但对SSR在食（药）用菌基因组或开放阅读框中的数量、构成和分布等特点也有研究[40,41]。

Barroso等[42]2000年首次报道了双孢蘑菇（Agaricusbbisporus）及侧耳（Pleurotusspp）中存在（TATG）n基序；秦莲花等[43]也发现香菇基因组中存在（TATG）n 基序；Rosa等[44]利用（GT）9和（GA）9做探针，分别在P.eryngii 和P.ferulae中鉴定了GT 和GGAA2个微卫星标记。

这些都为在食用蕈菌遗传育种研究中发展SSR标记做了有益的探索。

微卫星引物的开发成本较高，一般不可能为鉴定专门开发引物。

不过，可以利用微卫星在种间、属间的保守性，在不同种或品种间使用，徐立安等[45]（2001）在用栎属SSR引物研究栲属树种时，发现SSR的保守性为64%。

相信随着科技的发展，SSR引物的开发更加快捷，成本更低，这样，SSR标记技术就可以更好的服务到品种鉴定中去[46]。

１．１．５ＩＳＳＲ标记
ISSR（inter-simplesequencerepeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR 引物来扩增重复序列之间的区域。

其原理具体是，ISSR标记的原理是根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。

用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR 的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR 扩增[47]。

ISSR标记可广泛应用于动植物及微生物种质鉴定、遗传作图和基因定位，尤其在分子遗传学基础贫乏的作物研究中显示出极大的优势[48]。

LianCL等[49]利用ISSR标记研究了外生菌根菌松口蘑（Tricholomamatsutake）的居群遗传。

梁宇等[50]也采用ISSR标记。