用巢式和半巢式PCR检测转基因大豆Roundup Ready 及其深加工食品

*基金项目：国家“十五”“863”项目（2001AA212291）资助。

黄昆仑：1968年生，博士研究生，E-mail ：<hkl009@>.
**通讯作者。

Author for correspondence.E-mail ：<yunbol@>.收稿日期：2003-01-01接受日期:2003-04-16
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11(5):461~466
·研究论文·
用巢式和半巢式PCR 检测转基因大豆Roundup Ready
及其深加工食品*
黄昆仑
罗云波**
（中国农业大学食品学院,北京100083）
摘要：用从转基因大豆(
)颗粒中提取的DNA 作为模板，经过稀释，形成不同浓度梯度的DNA 溶液，然后用巢
式和半巢式PCR 进行扩增反应。

结果表明，巢式和半巢式PCR 均可以扩增DNA 浓度为10-14g/μL 的溶液。

用巢式和半巢式PCR 对市场的食品原料和深加工食品进行检测，可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因（housekeeping gene ）。

其中，2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因CaMV35S-基因片段，说明这些食品中含有转基因大豆成分，占被检测食品的76.5%。

用巢式PCR 和半巢式
PCR 检测转基因大豆Roundup Ready 和其深加工食品是一种有效的方法。

关键词：转基因大豆Roundup Ready ；食品；（半）巢式PCR ；检测
Detecting Genetically Modified Soybean Roundup Ready Ingredient in Foodstuffs
by Nested PCR and Semi-nested PCR
Huang Kunlun Luo Yunbo**
（Food Science College,China Agricultural University,Beijing 100083,China
）
DNA was extracted from GM soybean(
)Roundup Ready kernels and diluted a series of solutions ，and then
used for templates and amplified by nested PCR and semi-nested PCR.The result showed that the template concentration of 10-
14
g/μL DNA solution could amplified by nested PCR and semi-nested PCR.Different kinds of soybean foodstuffs from supermarket
were detected by nested PCR and semi-nested PCR ，the results showed that soybean housekeeping gene could be amplified
from 10kinds of foodstuffs （17kinds of brands food ），including soybean oil ，sauce ，lecithin ，bean curd ，soybean milk ，soyhean milk
etc.8kinds of foodstuffs （14kinds of brands food ）could be amplified segment of CaMV35S-，which indicated these foods were
made by soybean Roundup Ready ingredient.Therefore,nested PCR and semi-nested PCR are the effective methods for detecting GM
soybean
foodstuffs.
genetically modified soybean Roundup Ready;food;nested PCR and semi-nested PCR;detection
对转基因生物及其加工食品的检测，目前在国
际上比较认同的是利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR ）对转基因食品成分的遗传背景进行检测[1~6]。

由于许多食品在加工过程中DNA 受到了较大的破坏，可供利用的DNA 模板数量有限，容易造成由于DNA 模板数量太低不能得到足够PCR 产物而出现假阴性的结果[7]。

同时，由于加工食品的成分比较复杂，对DNA 模板质量
会产生较大的影响，造成了检测结果假阴性概率的
增加。

因此，研究利用适当的DNA 提取方法和PCR 检测方法显得尤为重要。

巢式PCR （nested PCR ）是
在普通PCR 基础上发展起来的一种PCR 技术，
在分子生物学研究和医学检测方面研究较多[8~11]。

其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR 反应对某个基因进
行检测。

通常第一次采用能扩增较大片段的引物，
经
农业生物技术学报2003年
过20~30次循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。

半巢式PCR（semi-nested PCR）的原理与巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有一对半引物，有一个引物被用于二次PCR 反应中。

这两种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。

因此，可以应用于对转基因食品进行PCR检测。

本研究将巢式和半巢式PCR技术应用于对转基因大豆Roundup Ready及其加工食品的定性检测，以解决由于食品的深加工对DNA分子造成的严重破坏以及在DNA提取过程中DNA损失较多，而造成的普通PCR方法难于检测和提高假阴性率的弊病，探索一种可以有效定性检测食品中是否含有转基因大豆Roundup Ready成分的方法，为我国的定性检测转基因食品提供相应的技术平台。

1材料和方法
1.1材料
转基因大豆()Roundup Ready为中国农业科学院品种资源研究所馈赠，大豆食品或含大豆成分食品为超市购买。

1.2DNA的提取
采用本实验室的LH-Smart DNA提取试剂盒。

大豆颗粒先用1%的升汞溶液消毒，用无菌水清洗干净后，再用无菌水浸泡24h。

将一粒大豆放入1.5 mL的离心管中，用灭菌的新玻璃棒拈碎，加入1.2 mL的LHⅠ溶液。

固体或粉状食品用研钵研碎食品，称取150mg放入1.5mL的离心管中，加入1.2 mL的LHⅠ溶液。

大豆油取10mL、大豆磷脂2g加入30mL正己烷溶解，再加入1.0mL的LHⅠ溶液，振荡30s后，在2300离心30s，以促进分层，吸取下层水相600μL放入1.5mL的离心管中。

豆腐、面酱等取300mg放入1.5mL的离心管中，加入1.2mL的LHⅠ溶液。

酱油等溶液状食品适当加热蒸发部分水分后，取300mL放入1.5mL的离心管中加入1.2mL的LHⅠ溶液。

将上述处理过的样品在75℃水浴中保温30 min，常温下12300离心3min，取上清液600
μL，加入1.5倍的LHⅡ溶液，在冰浴上放置15min 后，在4℃下12300离心10min。

弃上清液，加入1mL70%的预冷乙醇，剧烈振荡20s后，常温下12300离心2min，弃上清液。

加入65℃预热的Wash Buffer溶液700μL，剧烈振荡1min后，常温下12300离心3min。

取上清液600μL，加入等量冰冷异丙醇，冰浴沉淀10min后，在4℃下12300离心10min。

弃上清液，沉淀用500μL 70%的乙醇洗两遍，干燥后，用100mL ddH2O溶解，最后在-20℃贮备。

1.3DNA的纯化与不同浓度DNA溶液的配制
将提取的大豆基因组DNA通过电泳，切取后用上海生物工程公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化，并用BioMate5Unicom紫外分光光度计定量后，稀释成不同的浓度。

1.4引物序列
巢式PCR引物设计参考van Hoef等[4]，在Primer Primer5.0引物设计软件上对引物序列做了一些改动。

第一对引物扩增343bp片段，其中引物FristF在花椰菜花叶病毒启动子区域，FristR在叶绿素转移肽编码基因区域：FristF：(5'TGTGCT GTA GCC ACT GAT GC3')；
FristR：(5'TGATGTGATATCTCCACTGAC3')。

第二对引物扩增147bp片段，其中SecondF在花椰菜花叶病毒启动子区域，SecondR 在叶绿素转移肽编码基因区域：
SecondF:(5'TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3')；
SecondR:(5'CTGACGTAAGGGATGACGC3')。

半巢式PCR引物设计参考Carolyn等[5]，在Primer5.0引物设计软件上对引物序列做了一些改动。

SPA:(5'CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTC3')；
SPB:(5'CTTCTGTGCTGTAGCCACTGATGC3')；
SPC:(5'TTGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3')。

其中，SPA/B引物扩增320bp片段；SPA/C引物扩增120bp片段。

用于巢式PCR扩增大豆Lectin基因的引物：
第一对引物扩增412bp片段：
FSL1(5'GATGGATCTGATAGAATTGAC3')；
RSL1(5'GCCGAAGCAACCAAACATG3')。

第二对引物扩增112bp片段：
FSL2(5'CATCTGCAAGCCTTTTTGTG3')；
RSL2(5'CTCTACTCCACCCCCATC3')。

1.5PCR反应条件
反应为25μL体系：1×PCR反应Buffer，1.5 mmol/L Mg2+，0.3U聚合酶(大连宝生物公司)，引物浓度0.4μmol/L，4种dNTP各200mmol/L，DNA模板按如下加入。

巢式PCR，第一轮PCR反应：
3.4×10-7g/μL，3.4×10-8g/μL，3.4×10-9g/μL，
462
第5期黄昆仑等：用巢式和半巢式PCR 检测转基因大豆Roundup Ready 及其深加工食品3.4×10-10g/μL ，3.4×10-11g/μL ，3.4×10-12g/μL ，
3.4×10-13g/μL ，3.4×10-14g/μL ，无菌水,各加5μL ，不足部分用无菌水补足25μL ；
第二轮PCR 反应:用第一轮PCR 反应产物作为模板，分别加入1μL 产物,不足部分用无菌水补足25μL ；
半巢式PCR 与巢式PCR 相同。

反应时，在第一轮PCR 反应中采用：95℃5min ，30循环95℃30s 、60℃1min 、72℃1min ，最后反应在72℃5min 。

第二轮PCR 反应中采用：95℃5min ，35循环95℃30s 、60℃30s 、72℃30s ，最后反应在72℃5min 。

2结果和分析
2.1DNA 提取质量
在大豆颗粒和大豆粉中可以提取出较高质量的DNA ，在大豆食品和含大豆成分的食品中，由于加工使DNA 降解和变性严重，因此在琼脂糖凝胶电泳中不能看见DNA 条带，在部分食品中可以看见片状弥散的DNA 降解（图1）。

通过在紫外分光光度计260nm 的检测，可以粗略估算出提取的DNA 含量：大豆颗粒在0.28~0.36μg/μL ，大豆粉在0.31~0.37μg/μL ，豆奶粉在0.09~0.13μg/μL ，大豆油在0.03~0.06μg/μL ，大豆磷脂在0.04~0.08μg/μL ，含大
豆成分食品太阳锅巴在0.06~1.30μg/μL 。

2.2巢式PCR
在第一轮PCR 反应中，PCR 扩增产物在琼
脂糖凝胶电泳中可以看见PCR 的检测下限是
10-8g/μL 。

而通过第二轮的扩增后，PCR 的检测下限已达到10-14g/μL 。

说明通过巢式PCR 后，
PCR 的检测下限下降了6个数量级以上（图
2）。

在用大豆基因做巢式PCR 反应时，
也取得了同样的结果（图3）。

在大豆油和大豆
磷脂的PCR 扩增，用普通PCR 不能扩增出大豆基因，即使偶尔扩增出，重复性也很差。

用巢式PCR 扩增这些经过剧烈加工的食
品，可以扩增出大豆基因，并且，
重复再现性达到90%以上。

在对大豆食品或含大豆食
品的检测中，可以从甜面酱、
酱油、豆奶粉、锅巴等食品中扩增出大豆基因，并且，还从大
部分产品中扩增出了转基因成分，说明这些产
品在加工时采用了转基因大豆（表1）。

因此，
用巢式PCR 不仅可以满足对转基因大豆原料
的检测，而且可以从剧烈加工的食品中，在DNA 大量降解的情况下，有效地检测食品中是否含有转基因成分。

2.3半巢式PCR
利用半巢式PCR 对CaMV35S 启动子和
基因之间的DNA 片段进行扩增，效果
与巢式PCR 是相同的，PCR 的检测下限也超过了
10-14g/μL （图4）。

因此，
半巢式PCR 同样可以用于对转基因大豆及其加工品的检测。

3讨论和结论
3.1食品中DNA 的提取
食品是一个复杂的物质体系,不同的食品其成分也各有差异。

对食品中DNA 的提取方法会影响DNA 的质量和PCR 的扩增效果，目前的文献报道认为Promaga 的Wizard kit 提取方法比较好，但是价格比较昂贵[6]。

本研究中用CTAB 法、SDS 法、PEG 法、碱法等方法对食品中DNA 进行了提取研
图1.1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量Fig.1.Quality of extracted DNAs in 1.5%TAE agarose gels 上样量10μL 。

M ，λDNA Ⅲ/R Ⅰ双切marker ；1，锅巴；2，大豆磷脂；3，大豆油；4，豆奶粉；5，大豆粉；6，大豆颗粒。

DNAs （10μL ）were electrophoresed.M ，DL2000marker ；1，chips ；2，soybean lecithin ；3，soybean oil ；4，soybean milk ；5，soybean flour ；6，soybean kernel.图2.巢式PCR 检测CaMV35S-基因的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2.Electrophoretic profile of PCR products amplified from CaMV35S-gene by nest-PCR M ，DL2000marker ；A ，3.4×10-7g/μL ；B ，3.4×10-8g/μL ；C ，3.4×10-9g/μL ；D ，3.4×10-10g/μL ；E ，3.4×10-11g/μL ；F ，3.4×10-12g/μL ；G ，3.4×10-13
g/μL ；H ，3.4×10-14g/μL ；I ，negative control
.463
农业生物技术学报
2003年
表1用巢式和半巢式PCR 定性检测市场食品含转基因大豆成分情况
Table 1Market's foodstuffs analyzed for the presence of soybean DNA and Roundup Ready ingredient by nested and semi-nested PCR
食品种类后的数字表明不同品牌的产品。

电泳检测时，当10μL PCR 扩增产物的亮度大于5μL DL-2000marker 时用+++表示，相当时用++表示，小于时用+表示，没有扩增时用-表示。

The number of foods indicates different trademark.In agarose gel,+++indicates that signal of 10μl PCR's products is stronger than that of 10μL DL-2000marker;++indicates that both signal are equal;+indicates that signal of 10μL PCR's
products is fainter than that of 10μL DL-2000marker;-indicates no signal.
Samples 35S-(nested PCR)(nest PCR)35S-(semi nest PCR)GMOs'ingredient yes or no 343bp 147bp 412bp 118bp 320bp 120bp 大豆种子（阳性对照）++++++++++++++++++是Yes Soybean seed(positive)大豆种子（阴性对照）--++++++--否No Soybean seed(negative)大豆粉1++++++++++++++++++是Yes Soybean flour 1大豆粉2++++++++++++++++++是Yes Soybean flour 2锅巴1Chip 1++++++++++++++是Yes 锅巴2Chip 2-+++++++-+++是Yes 豆油1-++-++-++是Yes Soybean oil 1豆油2-++-++-+是Yes Soybean oil 2面酱1-++-++-++是Yes Mianjiang 1面酱2---++--否No Mianjiang 2豆腐1---++--否No Bean curd 1豆腐2---++--否No Bean curd 2豆奶粉1+++++++++++++++是Yes Soybean milk 1豆奶粉2++++++++++++++++是Yes Soybean milk 2豆浆Soy milk ---++--否No 大豆磷脂1-++-++-++是Yes Soybean lecithin 1大豆磷脂2-++-++-
++
是Yes
Soybean lecithin 2酱油1Sauce 1-+++-+++-+++是Yes 酱油2Sauce 2
-
+++
-
+++
-+++
是再藻泽
464
第5期黄昆仑等：用巢式和半巢式PCR 检测转基因大豆Roundup Ready 及其深加工食品图3.巢式PCR 检测大豆基因的琼脂糖凝胶电泳图
Fig.3.Electrophoretic profile of PCR products amplified from
gene by nest-PCR
M ，DL 2000marker ；A ，3.4×10-7g/μL ；B ，3.4×10-8g/μL ；C ，3.4×10-9g/μL ；D ，3.4×10-10g/μL ；E ，3.4×10-11g/μL ；F ，3.4×10-12g/μL ；G ，3.4×10-13g/μL ；H ，3.4×10-14g/μL ；I ，negative control.
图4.半巢式PCR 检测转基因大豆的琼脂糖凝胶电泳图Fig.4.Electrophoretic profile of PCR products amplified from gene by semi-nest PCR M ，DL 2000marker ；A ，3.4×10-7g/μL ；B ，3.4×10-8g/μL ；C ，3.4×10-9g/μL ；D ，3.4×10-10g/μL ；E ，3.4×10-11g/μL ；F ，3.4×10-12g/μL ；G ，3.4×10-13g/μL ；H ，3.4×10-14g/μL ；I ，negative control
.究，发现这些方法在DNA 提取质
量和数量上不能满足PCR 的需要。

因此，我们通过研究建立了从
食品中提取DNA 的有效方法，
通过验证可以满足PCR 扩增。

3.2巢式PCR 和半巢式PCR
巢式PCR 和半巢式PCR 以其的特异性和灵敏性已广泛应用于疾病的检测，以及许多分子生
物学的研究领域[12~15]。

从理论上来说，用巢式和半巢式PCR 可以检测到低于10-14g/μL 的DNA 模板量，但实际上由于食品中DNA
的破坏，可供利用的有效模板可能会远远低于其通过紫外分光光
度计测定的DNA 模板量。

但这并不影响巢式PCR 和半巢式PCR
对转基因食品的扩增。

研究结果
表明，在DNA 受到严重破坏的大
豆加工品豆油、大豆磷脂以及其
它产品中，用普通PCR 不能完全
检出是否含有大豆成分和转基因
大豆的成分，即使检出，其重复性
也不好。

而利用巢式PCR 和半巢式PCR 可以克服
普通PCR 的这一缺陷。

在用巢式和半巢式PCR 对
市场的食品原料和深加工食品进行检测时，可以从
大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原
料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆
内标基因（housekeeping gene ）。

其中，2种食
品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出
外源基因CaMV35S-基因片段，说明这些食品
中含有转基因大豆成分，
占被检测食品的76.5%。

在研究中还发现，不同公司和不同批次的DNA 聚合酶对普通PCR 的扩增效率和检测下限有
较大的影响，而对巢式PCR 和半巢式PCR 的扩增
反应影响相对较小。

因此，
巢式PCR 和半巢式PCR 技术抗干扰性也是比较好的。

一般来说，巢式PCR
和半巢式PCR 具有高度的特异性，
其结果一般不需要再用其他方法来验证[12]。

这是巢式PCR 和半巢式PCR 用于检测深加工转基因食品的另一优点。

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