发酵液中纳他霉素含量快速检测方法研究_魏宝东

基金项目：沈阳农业大学中青年硕士导师资助课题（２００５０３）
作者简介：魏宝东（１９６９－），男（汉），博士，副教授，主要从事果蔬贮藏保鲜及食品微生物方面的教学和科研工作。

＊通讯作者
魏宝东１，郑凤娥１，孟宪军１，＊，张平２，黄艳凤２，李江阔２
（１．沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳１１０１６１；２．国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津３００３８４）
发酵液中纳他霉素含量快速检测方法研究
摘
要：对紫外分光光度法和高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定纳他霉素的各项参数进行了研究，结果表明：紫外分光光
度法，确定甲醇＋１％冰乙酸（ｐＨ３．４）为提取剂，配比为１：９，３０３ｎｍ为检测波长，以纳他霉素标准溶液做标准曲线，求得线性回归方程为Ｙ＝０．１０６６Ｘ－０．００６９，Ｒ２＝０．９９９５，纳他霉素回收率超过９９．９３１４％。

紫外分光光度法与高效液相色谱法两种检测方法结果基本一致，以高效液相色谱为基准，紫外分光光度法的相对误差为０．１７％。

最终确定高效液相色谱法作为检测发酵液中纳他霉素含量的方法。

检测波长：３０３ｎｍ；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸体积比为７０∶３０∶２；流速：１．００ｍＬ／ｍｉｎ；检测器Ｗａｔｅｒｓ２９９６二极管阵列检测器；线性回归方程为Ｙ＝１２５００Ｘ＋１２６００，Ｒ２＝０．９９９５，精密度试验结果：平均ＲＳＤ为０．７５３％。

当信噪比为３时的最小检测限为３１ｎｇ。

关键词：纳他霉素；纳塔尔链霉菌；快速检测
纳他霉素（ｎａｔａｍｙｃｉｎ，又称ｐｉｍａｒｉｃｉｎ）是我国批准使用的天然食品生物防腐剂之一，广泛应用于食品、医药等行业。

目前报道的纳他霉素的检测方法主要有生物检定法、薄层层析法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等［１￣３］。

其中ＨＰＬＣ法主要用于食品中纳他霉素残
留量及高纯度纳他霉素产品的检测分析［４￣５］，紫外分光光度法一般作为常规对照，薄层层析法主要用于定性分析。

目前还没有统一的国家标准，本文采用紫外分光光度法和高效液相色谱法对纳他霉素生产菌株纳塔尔链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）发酵液中纳他霉素的含量测定进行研究，旨在为纳他霉素的菌种选
育、发酵工艺及分离提取等研究过程中，建立一套快速检测技术。

１试验材料
ＴＨＥＲＥＳＥＡＲＣＨＯＦＲＡＰＩＤＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮＭＥＴＨＯＤＳＯＦＮＡＴＡＭＹＣＩＮＩＮＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮＳＯＬＵＴＩＯＮ
ＷＥＩＢａｏ－ｄｏｎｇ１，ＺＨＥＮＧＦｅｎｇ－ｅ１，ＭＥＮＧＸｉａｎ－ｊｕｎ１，＊，ＺＨＡＮＧＰｉｎｇ２，ＨＵＡＮＧＹａｎ－ｆｅｎｇ２，ＬＩＪｉａｎｇ－ｋｕｏ２
（１．ＦｏｏｄＣｏｌｌｅｇｅ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０１６１，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｉｃ（ＵＶ）ａｎｄｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ（ＨＰＬＣ）ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉ－ｎａｔｉｏｎｏｆｎａｔａｍｙｃｉｎｉｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＵＶｍｅｔｈｏｄｓｈｏｗｔｈａｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｖｅｎｔｗａｓｍｅｔｈａｎｏｌｓｐｉｋｅｄｗｉｔｈ１％ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄｗｉｔｈｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｗａｓ１：９．Ｔｈｅ３０３ｎｍｗａｓｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅａｂｓｏｒｂａｎｃｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｌｏｇ－ｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎｗａｓＹ＝０．１０６６Ｘ－０．００６９ａｎｄｃｏｒｒｅｌａ－ｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ（Ｒ２）＝０．９９９５．Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｌａｃｋ－ｏｆ－ｆｉｔｔｅｓｔｏｆＵＶｍｅｔｈｏｄｗａｓｏｖｅｒ９９．９３１４％．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆＵＶｍｅｔｈｏｄｗａｓ０．１７％ｏｐｐｏｓｉｔｅｄｔｏｔｈｅＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄ．ＨＰＬＣｗａｓｖａｌｉｄａｔｅｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：３０３ｎｍ，ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅ：ｍｅｔｈａｎｏｌ：ｗａｔｅｒ：ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ７０：３０：２（ｖ／ｖ），ｆｌｏｗｓｐｅｅｄ１．００ｍＬ／ｍｉｎｗｉｔｈＷａｔｅｒｓ２９９６ｄｉｏｄｅ－ａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌｏｇ－ｌｉｎｅａｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎｗａｓＹ＝１２５００Ｘ＋１２６００ａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ（Ｒ２）＝０．９９９５．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔ：ｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＲＳＤ）ｏｆＨＰＬＣｗａｓ０．７５３％．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓ３１ｎｇａｓｔｈｅｓｉｇｎａｌｎｏｉｓｅｒａｔｉｏｗａｓ３．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔａｍｙｃｉｎ；Ｓ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ；ｒａｐｉｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｎａｔａｍｙｃｉｎ
注：发酵液：提取剂为１：９（体积比），充分振荡５ｍｉｎ。

菌种：（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）ＡＴＣＣ２７４４７。

纳他霉素标准品色谱纯（９９．５％），Ｓｉｇｍａ公司。

发酵培养基（ｇ／Ｌ）：大豆蛋白胨２０、酵母浸粉４．５、ｐＨ７．５、
葡萄糖４０，１２１℃，灭菌１５ｍｉｎ￣２０ｍｉｎ。

２试验方法
２．１
标准溶液的制备
称取纳他霉素标准品，用甲醇
溶解并定容，配成浓度为５００ｍｇ／Ｌ的纳他霉素贮备液。

临用时用甲醇稀释到所需浓度即得纳他霉素标准溶液，经０．４５μｍ微孔滤膜过滤后，滤液用于测定。

２．２样品溶液制备取１ｍＬ纳他霉素发酵液，加
入９ｍＬ１％冰醋酸的甲醇溶剂，在振荡器上充分振荡５ｍｉｎ后离心（５０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ）除去菌丝体，取
１ｍＬ上清液，用１％冰醋酸的甲醇溶液进行适当稀释后高速离心（１００００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ），取上清液经
０．４５μｍ微孔滤膜过滤后备用。

２．３定性与定量测量
２．３．１紫外分光光度法定性与定量测定
处理好的发酵液在波长２００ｎｍ￣３５０ｎｍ范围内进行波长扫描，将图谱与纳他霉素的紫外扫描图谱进行对照。

根据扫描图谱中２９０ｎｍ、３０３ｎｍ、３１８ｎｍ处的吸光度值分别用“一点法”
进行定量。

２．３．２高效液相色谱法定性与定量测量
在相同色谱条件下，将样品色谱图与纳他霉素标准液色谱图进行对照，根据保留时间进行样品中纳他霉素定性。

在样液中加入一定量的纳他霉素标准液，以进一步确定；在标样与样品进样量相同的情况下，用外标法定量，计算出样品中纳他霉素的含量。

３结果与分析
３．１紫外分光光度计法快速测定纳他霉素含量３．１．１提取试剂的确定
如表１所示：１０种提取试剂以含１％冰乙酸的甲醇（ｐＨ３．４）溶剂作为提取试剂，提取量最高为０．９６ｇ／Ｌ
，其次是甲醇（ｐＨ６．８）和甲醇＋５％冰乙酸（ｐＨ２．７）的为
０．９２ｇ／Ｌ，再次是甲醇＋０．１％冰乙酸（ｐＨ４．４）为０．８９ｇ／Ｌ，其他几种提取剂提取效果较差，尤其是冰乙酸＋水
（５＋４０）和甲醇＋１０％氨水（ｐＨ１３．２）提取率仅是甲醇＋１％冰乙酸（ｐＨ３．４）提取剂的５８．３３％、５９．３８％；从保持纳他霉素稳定性来看，含有冰乙酸的提取剂均较稳定，其次是甲醇提取剂，含氨水的提取剂最不稳定，可见冰乙酸具有稳定剂的作用；前７种提取剂提取杂质较少，扫描图谱显示干扰少。

初步确定甲醇＋１％冰乙酸（ｐＨ３．４）为提取剂。

３．１．２提取剂比例的确定
确定提取剂后，对提取剂比例进行了研究（见表
２），表２结果表明提取剂配比达到１：８以上提取效果相同，为了方便计算选择１∶９的配比。

３．１．３检测波长的确定
将纳他霉素的标准品配成６．５ｍｇ／Ｌ的１％冰醋酸甲醇溶剂，测定其紫外吸收光谱图，结果见图１。

从光谱图上可以看出，纳他霉素的最大吸收峰位置在波长
３０３ｎｍ处。

表１
提取剂对提取效果的影响
Ｔａｂｌｅ１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔａｎｔ
提取剂Ｅｘｔｒａｃｔａｎｔ甲醇Ｍｅｔｈａｎｏｌ（ｐＨ６．８）
冰乙酸＋水（５＋４０）
Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ＋Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ（５＋４０）
甲醇∶水∶冰乙酸（６０∶４０∶５）
Ｍｅｔｈａｎｏ：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ：Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（６０∶４０∶５）
甲醇＋０．１％冰乙酸（ｐＨ４．４）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋０．１％Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ｐＨ４．４）
甲醇＋１％冰乙酸（ｐＨ３．４）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋１％Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ｐＨ３．４）
甲醇＋５％冰乙酸（ｐＨ２．７）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋５％Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ｐＨ２．７）
甲醇＋１０％冰乙酸（ｐＨ２．３）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋１％Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ｐＨ２．３）
甲醇＋０．１％氨水（ｐＨ９．８）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋０．１％Ａｍｍｏｎｉａｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ９．８）
甲醇＋１％氨水（ｐＨ１１．３）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋１％Ａｍｍｏｎｉａｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ１１．３）
甲醇＋１０％氨水（ｐＨ１３．２）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ＋１０％Ａｍｍｏｎｉａｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ１３．２）
１ｈ０．９２０．５６０．７３０．８９０．９６０．９２０．８６０．８５０．７３０．５７２４ｈ０．８７０．５６０．７２０．８８０．９５０．９１０．８００．７２０．３９０．２５３６ｈ０．８５０．５４０．７２０．８８０．９５０．８９０．７８０．２７０．２５０．１９
杂质干扰
Ｉｉｍｐｕｒｉｔｙｉｎｔｅｎｆｅｒｅｎｃｅ
少少少少少少少多多多
表２
提取剂配比对提取效果的影响
Ｔａｂｌｅ２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔａｎｔｍａｔｃｈｉｎｇ
比例Ｒａｔｉｏ纳他霉素含量（ｇ／Ｌ）Ｎａｔａｍｙｃｉｎｃｏｎｔｅｎｔ（ｇ／Ｌ）
１∶１０．４８１∶２０．５４１∶３０．６１１∶４０．７０１∶５０．８１１∶６０．８９１∶７０．９２１∶８０．９６１∶９０．９６１∶１００．９６
注：发酵液：提取剂为１∶９
（体积比），充分振荡５ｍｉｎ。

提取后不同时间纳他
霉素含量（ｇ／Ｌ）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ）
表３
纳他霉素回收率结果（ｎ＝５）
Ｔａｂｌｅ３ＲｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｏｆＮａｔａｍｙｃｉｎ（ｎ＝５）
本底值（ｇ／Ｌ）Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｖａｌｕｅ（ｇ／Ｌ）０．３５００．３５００．３５０加入值（ｇ／Ｌ）
Ａｄｄｉｎｇｖａｌｕｅ（ｇ／Ｌ）
０．０３５０．３５０３．５００平均回收率（％）
Ａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ（％）１００．２８６０９９．９３１４９９．９３２０ＲＳＤ
（％）０．９００９０．３６６５０．４００７０．０３４７０．３４７８３．４７９１０．０３５１０．３５０７３．５０８８０．０３４９０．３４９６３．４９３１０．０３５５０．３５１１３．４９２９０．０３５３０．３４９６３．５１４２
表４
流动相和流速对纳他霉素保留时间的影响
Ｔａｂｌｅ４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅａｎｄｔｈｅｖｅｌｏｃｉｔｙｏｎｒｅｔｅｎｔｉｏｎ
ｔｉｍｅｏｆＮａｔａｍｙｃｉｎ流动相配比（甲醇：水：冰乙酸）
Ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｍａｔｃｈｉｎｇ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ：Ｇｌａｃｉａｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）
６５∶
３５∶２．３７０∶３０∶２
７５∶２５∶１．７
８０∶２０∶１．４
流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
Ｆｌｏｗｒａｔｅ
（ｍＬ／ｍｉｎ）
０．８０１．００１．２００．８０１．００１．２００．８０１．００１．２００．８０１．００１．２０保留时间（ｍｉｎ）
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）１２．５６２１１．９６３１０．８２７９．１６８８．７３２７．９０２１７．８２４７．４５１６．７４３７．２１９６．８７５６．１８８
实测值与本底值之差（ｇ／Ｌ）
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｍｅａｓｕｒｅｄｖａｌｕｅａｎｄｂａｃｋｇｒｏｕｎｇｖａｌｕｅ（ｇ／Ｌ
）图２为用１％冰醋酸甲醇溶剂提取的发酵液中纳他霉素的紫外检测谱图，它的谱图与纳他霉素标准品的谱图图形一致，吸收峰位置相同。

它的最大吸收峰位置也在波长３０３ｎｍ处。

故选择３０３ｎｍ为检测波长。

３．１．４标准曲线
以质量浓度为１、２、３、４、５、６、７、８、９ｍｇ／Ｌ的纳他霉素标准溶液做标准曲线，结果见图３。

求得线性回归方程为ｙ＝０．１０６６ｘ－０．００６９Ｒ２＝０．９９９５，说明本方法在
１ｍｇ／Ｌ￣９ｍｇ／Ｌ范围内线性关系良好。

３．１．５回收率和精密度试验结果
取处理后的发酵液样品分成３份，１份作为本底值，另２份添加已知质量浓度的标准液，分别测出纳他霉素在样品中的含量，再根据检测量计算出纳他霉素的回收率，结果表明回收率超过９９．９３１４％，ＲＳＤ（Ｒｅｌ－
ａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ，相对标准偏差）分别为０．９００９、
０．３６６５和０．４００７，见表３。

３．２高效液相色谱法测定纳他霉素含量３．２．１流动相和流速的确定
检测样品制备同紫外分光光度法。

Ｃａｐｉｔａｎｖａｌｌｖｅｙ
（２０００）采用乙腈－３０ｍｍｏｌ／Ｌ高氯酸（体积比为３５∶６５，ｐＨ值为１．６）作为流动相。

但考虑到乙腈价格较高，流动相ｐＨ过低，且高氯酸具有强腐蚀性等造成对分离柱的损害，故参考其他文献［２，６］，分别配制甲醇、水、冰醋酸不同配比的流动相和不同流速（０．８０、１．００、
１．２０ｍＬ／ｍｉｎ）条件下的分离情况进行研究，结果见表４。

由表４可知：同一流速随着甲醇和水比例的增加以及同一流动相随流速的增加，保留时间均缩短，其中甲醇：水：冰乙酸体积比为６５∶３５∶２．３的流动相，保留时间过长，纳他霉素色谱峰过宽出现拖尾，含有杂质峰分离效果不好；甲醇：水：冰乙酸体积比为７５∶２５∶１．７的流动相和甲醇：水：冰乙酸体积比为８０∶２０∶１．４的流动相保留时间过短，纳他霉素色谱峰同前边的杂峰分
不开，峰型不好；只有甲醇：水：冰乙酸体积比为７０∶３０∶２的流动相保留时间比较适宜，纳他霉素色谱峰同前边的杂峰能分开，峰不拖尾。

流速虽然能影响保留时间，但对峰型影响不大，考虑到柱压的因素最终选用流速为１．００ｍＬ／ｍｉｎ。

确定的色谱分析条件为色谱柱
ＷａｔｅｒｓＮｏｖａ－Ｐａｋ○ＲＣ１８１５０ｍｍ×３．９（ｉｄ）ｍｍ不锈钢柱；流动相为甲醇：水：冰乙酸体积比为７０：３０：２；流速ｌ．００ｍＬ／ｍｉｎ；检测器Ｗａｔｅｒｓ２９９６二极管阵列检测器，波长３０３ｎｍ；进样量５μＬ；灵敏度０．０２ＡＵＦｓ；柱温室温。

３．２．２标准曲线的测定
准确吸取不同浓度的标准溶液依次进样５μＬ。

以峰面积Ａ（ｍＶ・ｓ）对质量浓度Ｃ（ｇ／Ｌ）作图（见图４），由图４
表５
精密度试验
Ｔａｂｌｅ５Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｔｅｓｔｏｆｓａｍｐｌｅ
时间（ｈ）
Ｔｉｍｅ（ｈ）
１
３
５
７
９
１１
日内ＲＳＤ（％）ＳａｍｅｎｅｓｓＤａｙＲＳＤ（％）
日间ＲＳＤ（％）
ＤｉｆｆｅｒＤａｙＲＳＤ（％）１．０８３２０．６１５００．６４７６０．６２０９０．７６１９０．７２１９
１（ｄ）
０．１２１４０．１２０１０．１１９２０．１２１００．１２０８０．１１９００．６５７３２（ｄ）１．１２２６０．１１９４０．１２１２０．１２０８０．１２１６０．１２１５０．４９４９３（ｄ）１．１１９６０．１２１６０．１２０５０．１１９８０．１１９００．１１９８０．７６０８４（ｄ）０．１１９８０．１２０８０．１１９３０．１１９２０．１１９８０．１２０１０．４７３５５（ｄ）０．１２０３０．１１９７０．１１９６０．１２０４０．１１９９０．１２１６０．６１０５６（ｄ）０．１１９１０．１２０４０．１２０２０．１１９４０．１２０７０．１２０９０．５９９０
纳他霉素浓度（ｇ／Ｌ）
Ｎａｔａｍｙｃｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ）
表６
回收率试验
Ｔａｂｌｅ６Ｒｅｃｏｖｅｒｙｔｅｓｔｏｆｓａｍｐｌｅ
纳他霉素浓度（ｇ／Ｌ）
Ｎａｔａｍｙｃｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｇ／Ｌ）本底值Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｖａｌｕｅ０．３５００加入值Ａｄｄｉｎｇｖａｌｕｅ０．０３５００．３５００３．５０００检出
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
０．３８３６
０．３９１００．３８４１０．３８７６
０．６９３０
０．７０２１
０．７０２００．６９８０
３．８５６０
３．９０１０３．８３４１３．８７９１
回收率（％）Ｒｅｃｏｖｅｒｙｔｅｓｔ（％）９９．６４１０１．５６９９．７７１００．６８
９９．００
１００．３０１００．２９９９．７１
１００．１６
１０１．３２９９．５９１００．７６
平均回收率（％）Ａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ（％）
１００．４１
９９．８３１００．４６ＲＳＤ
（％）
０．８９０．６２
０．７５可知，在质量浓度为０．０２ｇ／Ｌ￣０．４０ｇ／Ｌ，Ａ与Ｃ成良好的线性关系，其回归方程为ｙ＝１２５００ｘ＋１２６００，Ｒ２＝０．９９９５。

３．２．３标样及发酵液样品的分离色谱图
在上述优化的色谱条件下，标准品和经过处理后的发酵液样品得到充分洗脱和分离，保留时间分别为
８．７３２ｍｉｎ和８．７２８ｍｉｎ，得到纳他霉素标准品色谱图如图５所示，发酵液样品色谱图如图６所示。

从图５、６可知，在本色谱条件下，发酵液中的纳他霉素能得到很好的分离，保留时间与标准品基本一致，且无明显的干扰峰。

３．２．４精密度试验
准确吸取０．１２ｇ／Ｌ的标准品溶液５μＬ分别于同
１ｄ内的不同时间和不同日间（＜６ｄ）进行测定，计算其日内ＲＳＤ和日间ＲＳＤ，结果分别为０．４７４％￣０．７６１％
（ｎ＝６）之间和１．０８３％￣０．６１５％（ｎ＝６）之间，见表５。

３．２．５加样回收率试验及最低检测限
精密量取已测知含量的发酵液样品１２份，分成３组，每组添加已知量的标准品，进行样品溶液制备后，经取５μＬ进样（ｎ＝４）后，计算回收率和相对标准偏差。

试验结果见表６。

加样回收率分别为１００．４１％，９９．８３％和１００．４６％。

ＲＳＤ分别为０．８９％、０．６２％和０．７５％。

该方法具有操作简单、快速灵敏、准确性好等优点，可作为纳他霉素的定量分析方法。

当信噪比为３时纳他霉素的最小检测限为３１ｎｇ。

３．２．６两种检测方法结果的比较（见表７）
由表７可知对６批摇瓶发酵液采用ＨＰＬＣ进行测定，测得纳他霉素的质量浓度分别为２．６１ｇ／Ｌ、２．４０ｇ／Ｌ、２．４９ｇ／Ｌ、２．６８ｇ／Ｌ、２．５７ｇ／Ｌ、２．５０ｇ／Ｌ。

此外两种检测方法结果基本一致，以高效液相色谱为基准，紫外分光光度法的相对误差为０．１７％。

说明紫外分光光度法与高效液相色谱法接近，其相关系数为０．９９。

４讨论与结论
４．１讨论
ＨａｒｒｙＢｒｉｋ用０．１％醋酸的甲醇提取纳他霉素，其紫外光谱显示，在波长为２９０、３０３、３１８ｎｍ处有尖锐的最大吸收峰，因此确定紫外分光光度法可检测纳他霉素。

本试验采用提取剂１％冰醋酸的甲醇溶液在３０３ｎｍ，１ｍｇ／Ｌ￣９ｍｇ／Ｌ范围内线性关系良好。

但是纳他霉素在紫外线下很快发生降解，生成的四氮烯纳他酸与纳他霉素的紫外吸收光谱相同，影响该方法的定量分析稳定性；此外我们发现纳他霉素的甲醇溶液在检测过程中会发生最大吸收峰的漂移现象，用含１％冰醋酸的甲醇溶液提取后检测没有漂移现象，证明乙酸是波长稳定剂。

如何减小空白溶液中未经发酵的培养基成分同发酵液中培养基成分差别是对该检测方法准确性的考验。

本试验同高效液相比较平均相对误差为０．１７％，在发酵液中纳他霉素含量比较高时，由于稀释倍数很大（１０００倍以上），可减小这方面误差，在试验条件有限时，可用于定量分析。

陈冠群等、骆健美等报道了高效液相色谱测定发酵液中纳他霉素含量的方法，前者采用的色谱条件：色谱柱：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘｐｒｏｄｉｇｙ５μＯＤＳ３１００Ａ（２５０ｍｍ／４．６０ｍｍｉ．ｄ．，５μｍ）；流动相：甲醇∶水∶磷酸（体积比８５∶１５∶０．１５）；流速１ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：３０３ｎｍ；进样量２０μＬ．；外标法于室温下检测。

结果保留时间为１．９７２ｍｉｎ，可见在纳他霉素峰之后出杂质峰［７］；后者色谱分析条件色谱柱：大连依利特科学仪器有限公司ＨｙｐｅｒｓｉｌＢＤＳＣ１８（５μｍ，
４．６ｍｍ×２００ｍｍ）；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸（６０∶４０∶５体积比）；流速：１．００ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：３０２ｎｍ；进样量：１０μＬ；外标法于室温下检测。

结果保留时间为１３．９０３ｍｉｎ［８］。

本试验分别采用上述色谱条件进行检测结果表明：用前者保留时间过短，分离效果不好，杂质干扰多，用后者保留时间太长，柱压过高，流动相酸度低，对色谱柱损害严重，重新筛选色谱条件采用ＷａｔｅｒｓＮｏｖａ－ＰａｋＣ１８１５０ｍｍ×３．９（ｉｄ）ｍｍ不锈钢柱，检测波长为３０３ｎｍ，流动相为甲醇∶水∶冰乙酸体积比为７０∶３０∶２，流速ｌ．００ｍＬ／ｍｉｎ，检测温度为室温２０℃，进样量５μＬ，保留时间为８．７２８ｍｉｎ，ｐＨ在３．５左右，柱压较低，对色谱柱损害小，纳他霉素峰没有杂质峰干扰，且保留时间在１０ｍｉｎ之内，可以实现快速检测，表明该方法准确可靠是一种比较理想的定性定量方法。

文献报道当发酵液中纳他霉素的含量超过４ｇ／Ｌ时，其在甲醇中的溶解度与提取液的ｐＨ有关［９￣１０］。

本试验对提取液的ｐＨ进行研究表明，用１％冰醋酸甲醇（ｐＨ＝３．４）提取充分且冰乙酸有波长稳定剂作用。

证明降低ｐＨ能增大纳他霉素的溶解度。

４．２结论
４．２．１紫外分光光度计法快速测定纳他霉素含量确定甲醇＋１％冰乙酸（ｐＨ３．４）为提取剂，配比为１∶９，３０３ｎｍ为检测波长，以纳他霉素标准溶液做标准曲线，求得线性回归方程为ｙ＝０．１０６６ｘ－０．００６９，Ｒ２＝０．９９９５。

纳他霉素回收率超过９９．９３１４％。

４．２．２高效液相色谱法测定纳他霉素含量
３０３ｎｍ为检测波长；流动相：甲醇∶水∶冰乙酸体积比为７０∶３０∶２；流速：１．００ｍＬ／ｍｉｎ；线性回归方程为ｙ＝１２５００ｘ＋１２６００，Ｒ２＝０．９９９５；精密度试验结果：日内ＲＳＤ为０．４７４％￣０．７６１％（ｎ＝６），日间ＲＳＤ为１．０８３％￣０．６１５％（ｎ＝６）；平均加样回收率为１００．２３％；平均ＲＳＤ为０．７５３％。

当信噪比为３时的最小检测限为３１ｎｇ。

４．２．３两种测定方法结果的比较
两种检测方法结果基本一致，以高效液相色谱为基准，紫外分光光度法的相对误差为０．１７％。

参考文献：
［１］ＨａｒｒｇＢｒｉｋ．Ｎａｔａｍｙｃｉｎ．ＩｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌＰｒｏｆｉｌｅｓｏｆＤｒｕｇＳｕｂｓｔａｎｃｅｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．１９９４：５１４￣５５７．
［２］袁亦承．纳他霉素［Ｊ］．中国食品用化学品，１９９７，２（３）：３７￣４１．［３］Ｈ．ＨｕａｎｄＫ．ｏｃｈｉ．Ｎｏｖｅｌａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏ－ｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｂｙｉｎｄｕｃｉｎｇｃｏｍｂｉｎｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｕｔａ－ｔｉｏｎｓ．ＡｐｐｌａｎｄＥｎｖｉＭｉｃｒｏ．２００１，６７：１８８５￣１８９２．
［４］李东，李颖辉，陈婕．纳他霉素分析方法的研究进展［Ｊ］．中国食品添加剂，１９９９，ｌ：ｌ￣４．
表７两种检测方法的比较
Ｔａｂｌｅ７Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｗｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ
摇瓶发酵批次ＦｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆＳｈａｋｅｆｌａｓｋｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
１
２
３
４
５
６
相对误差（％）
Ｒｅｌａｔｉｖｅｅｒｒｏｒ
（％）
０．２５６
０．６９
－０．８０
０．６２
０．９１
－０．６６纳他霉素含量Ｎａｔａｍｙｃｉｎｃｏｎｔｅｎｔ（ｇ／Ｌ）
高效液相色谱法
ＨＰＬＣ
紫外分光光度法
ＵＶ－ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ
２．６３
２．４２
２．４７
２．７１
２．５８
２．５
２．６１
２．４１
２．４６
２．６８
２．５９
２．４８
２．６
２．４３
２．４９
２．７３
２．６１
２．４９
２．６２
２．４１
２．４９
２．７０
２．５７
２．５１
２．５９
２．３９
２．５１
２．６９
２．５６
２．４９
２．６１
２．４１
２．４８
２．６７
２．５８
２．５２
［５］ＣａｐｉｔａｎＶａｌｌｖｅｙ．ＲａｐｉｄｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｎｄｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＮａｔａｍｙｃｉｎｉｎｌａｃ－ｔｏｓｅｒｕｍｍａｔｒｉｘ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡＯＡＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０００，８３（４）：８０２．［６］王克利，张宣义，刘淳．ＨＰＬＣ法测定沙拉酱和干酪中纳他霉素含量方法的研究［Ｊ］．中国卫生检验杂志，１９９８，８（６）：３８．
［７］陈冠群，杨东靖，杜连祥．反相高效液相色谱法测定发酵液中的纳他霉素［Ｊ］．天津轻工业学院学报，２００３，１８（１）：９￣１１．［８］骆健美，金志华，岑沛霖．ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定发酵液中纳他霉素含量［Ｊ］．中国抗生素杂志，２００４，２９（１１）：６５３￣６５６．
［９］ＢｏｒｄｅｎＧ．Ｗ，ＭａｈｅｒＪ．Ｍ．，ＳｋｌａｖｏｕｎｏｓＣ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｎａｔａｍｙｃｉｎｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ：５．１９９９，９４２，６１１．
［１０］ＯｉｓｏｎＰ．Ｔ，ＭｉｌｌｓＪ．Ｒ．，ＲｅｉｍｅｒＭ．Ｈ．Ｎａｔａｍｖｃｉｎｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ：５．１９９７，５９１，４３８．）
收稿日期：２００６－１１－０４
苹果栽培在中国已有两千多年的历史，苹果在我国陕西、甘肃、山东都有广泛分布［１］。

苹果是一种营养价值较高的水果，其不仅富含水分，还含有大量的维生素、果胶等营养物质。

苹果所含的果糖与纤维，也比其它水果更能保持血糖稳定。

常食苹果可以降低血脂，对人体有很大的好处。

但由于苹果含有大量水分、呼吸作用很强，且在生长过程中还容易受到病菌的影响而发生采后的病害，所以不易保鲜贮藏。

要想解决苹果保鲜贮藏中存在的问题，必须了解苹果在采后的各种生理变化和影响苹果鲜度的因素。

本文简述了苹果采摘后的生理变化过程及目前国内外常用的水果保鲜技术，分析了影响苹果保鲜效果的因素，介绍了发展保鲜纸箱的概念。

１苹果采后的生理变化
１．１采后苹果的呼吸作用
采收后的苹果仍是一个生命的有机体，要不断地进行呼吸。

苹果的呼吸主要分为有氧呼吸和无氧呼吸［２］。

有氧呼吸是主要的呼吸方式，即在有氧的条件下，将底物彻底分解为二氧化碳和水的过程。

在无氧时，水果进行无氧呼吸，对水果也有不利影响。

在无氧
严丽，李新平＊
（陕西科技大学造纸工程学院，陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室，陕西咸阳７１２０８１）
苹果采后生理变化及保鲜方法研究进展
摘要：简述了苹果采摘后的生理变化过程及目前国内外常用的水果保鲜技术，提出了发展保鲜纸箱的概念。

关键词：苹果；生理变化；保鲜方法；保鲜纸箱
ＲＥＣＥＮＴＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＯＦＰＯＳＴ－ＨＡＲＶＥＳＴＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹＡＮＤＴＨＥＦＲＥＳＨ－ＫＥＥＰＩＮＧ
ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＯＦＡＰＰＬＥＳ
ＹＡＮＬｉ，ＬＩＸｉｎ－ｐｉｎｇ＊
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰａｐｅｒｍａｋｉｎｇＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰａｐｅｒｍａｋｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＳｐｅｃｉａｌｔｙＰａｐｅｒＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇ，Ｘｉａｎｙａｎｇ７１２０８１，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｏｆｐｏｓｔ－ｈａｒｖｅｓｔａｐｐｌｅｓｗａｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｆｒｅｓｈ－ｋｅｅｐ－ｉｎｇａｌｌｏｖｅｒｔｈｅｗｏｒｌｄｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｔｒｅｎｄｏｆｔｈａｔｔｅｃｈｎｉｑｕｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｆｒｅｓｈ－ｋｅｅｐｉｎｇｃｏｒｒｕ－ｇａｔｅｄｂｏｘｗｅｒｅｂｏｔｈｐｒｏｐｏｓｅｄｔｅｎｔａｔｉｖｅｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｐｐｌｅｓ；ｐｏｓｔ－ｈａｒｖｅｓｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；ｆｒｅｓｈ－ｋｅｅｐｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ｆｒｅｓｈ－ｋｅｅｐｉｎｇｃｏｒｒｕｇａｔｅｄｂｏｘ
基金项目：陕西科技大学科研创新团队建设项目（ＳＵＳＴ－Ｂ０８）。

作者简介：严丽（１９８３－），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：造纸化
学品及特种纸。

＊通讯作者：李新平，男，博士生导师，教授，研究方向：造纸化学品。

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