脲酶Km值测定

1/A （1/V）
斜率= Km/ Vmax
1/Vmax
-1/Km 0
1/C
讨论小结
• 酶促反应有什么特点？ • 测定酶促反应特征常数Km值有意义？
思考题：
• 1、脲酶的特征常数的特点是什么？ • 2、测定Km值有什么意义？ • 3、Km值的测定与临床疾病有何联系？
实验三 脲酶的Km值简易测定
1926年，美国生化学家Sumner从刀豆中 得到脲酶结晶，并证明了脲酶的本质是 蛋白质。1946年获得诺贝尔化学奖。
酶
• 是由活细胞合成的，对其特异底物起高 效催化作用的蛋白质，是机体内催化各 种代谢反应最主要的催化剂。
酶的特征常数
• Km值等于酶促反应速度为最大速度 一半时的底物浓度
蒸馏水
3
3
3
3
3
0.5mol/L NaOH 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分摇匀，静置5min，过滤，分别在滤液中加入以下试剂
滤液/mL 蒸馏水/mL 显色液/mL
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
• 迅速摇匀，用721型分光光度计，420nm，
以对照调零，测定各管A值。
实验操作
管号 脲液加入体积(mL)
1/15PB（mL） 脲酶液（mL） 煮沸脲酶液（mL）
1
2
3
4
0.2
0.134
0.1
0.08
0.6
0.666
0.7
0.720
-
-
-
摇匀 ，37度水浴15min
对照 0.08 0.720
-0.2
100g/L ZnSO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
• 酶促反应的特征常数只与酶的结构、底物 和反应环境（如温度、pH、离子强度）有
关，与酶的浓度无关。
实验目的
1. 阐述酶促反应中特征常数的特点和意义； 2. 说出利用比色法进行Km值测定的整个操作
步骤； 3. 思考Km值的测定对临床工作中的意义。
一 、原理
OC
NH2 NH2
脲酶
+ 2H2O
（NH4）2CO3
Vmax Vmax [S]
V=
=
2
Km + [S]
Km=[S]
Km值：当酶反应速率达到最大反应速率 一半时的底物浓度，单位是mol／L。
Km值最小的底物称为该酶的最适底物也 就是天然底物。
底物浓度对酶促反应速度的影响
v Vm
[S]与v关系：
Vm
当[S]很低时，[S]与v成比例-- 一级反应
2
等） • 酶促反应发生的环境（碱性条件，加入
NaOH；温度，37℃）
注意事项
1. 操作中每种试剂务必摇匀 2. 煮沸脲液时注意试管口不能对人，变性脲
酶液要煮沸变性彻底 3. 试管一定要清洗干净，防止其他残留液体
对实验的影响 4. 各组试管加样注意一致性，防止人为加样
造成的误差。重复测值，取平均数值
当[S]较高时，[S]与v不成比例
当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应
0
[S]
Km值与 Vmax值测定
双倒数作图法又称林-贝氏作图法（1934）
1
Km
1
1
=
+
V
Vmax [S]
Vmax
1/V
斜率= Km/ Vmax
1/Vmax -1/Km 0
1/[S]
酶促反应的原料
• 底物（脲液） • 酶（脲酶液） • 酶促反应所需的缓冲液（PBS，蒸馏水
(NH4)2CO3 + 8H2O + 4(KI)2HgI2
Hg
2O
NH2I + 6NaI + 8KI + Na2CO3 + 6H2O
Hg
碘化双汞铵（橙黄色）
米—曼氏方程
（Michaelis-Menten equation）
Vmax [S] V= Km + [S] 米-曼氏方程解释： 当[S]Km时，v＝ Vmax [S] /Km， 即v正比于[S] 当[S]Km时，v≈ Vmax, 即[S]而v不变