阿霉素的生产设计

1 绪论
1.1 引言
随着科学的进步和技术的发展，人们的健康问题有了很大的保障，近年来抗癌基因技术发展，抗癌基因药物也越来越有发展前景，其中最主要的抗癌药物是阿霉素。

在以前中国技术不发达的时候，中国只能从外国引进，这几年中国技术发展起来。

可以很好的运用发酵知识进行生产阿霉素的发酵工艺。

而且因为阿霉素是抗肿瘤产品，所以在设计工艺流程时要尽量考虑达到GMP要求。

1.1.1 阿霉素的结构
阿霉素英文名称为Doxorubicin,其他名称有14-羟基柔红霉素，14-羟基正定霉素，阿得里亚霉素，阿霉素-威力，多索柔比星，羟基红比霉素，羟基柔红霉素，威力啊霉素，亚德里亚霉素，亚法里亚霉素，阿霉素，14-羟正定霉素，14-羟柔红霉素，Adri。

其分子式为：C27H29NO11；结构如图1-1。

图1-1 阿霉素的结构
1.1.2 阿霉素的作用
本品为广谱抗肿瘤药，对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。

其作用机理主要是本品嵌入DNA而抑制核酸的合成。

临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、何杰金和非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞
瘤、膀胱瘤、甲状腺瘤、绒毛膜上皮癌、前列腺癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。

但是还会有些副作用：
1) 抑制骨髓造血功能，表现为血小板及白细胞减少。

2) 心脏毒性，严重时可出现心力衰竭。

3) 可见到恶心、呕吐、口腔炎、脱发、高热、静脉炎及皮肤色素沉着等。

4) 少数患者有发热、出血性红斑及肝功能损害。

1.1.3 阿霉素的工业发展前景
一直以来阿霉素生产都是由发酵产物柔红霉素经化学半合成而得到，存在工艺不稳定，成本高，环境污染大等问。

因此，利用发酵法生产阿霉素不但可以减少工艺流程，实现降本增效，同时还极大地减少有毒物质的排放，达到清洁生产的目的。

1.2 链霉菌的简介
链霉菌是放线菌的典型代表，广泛分布于含水量较低，通气良好，有机质丰富和微碱性的土壤中，在淡水，海水，及其淤泥中也有分布。

少数是人体和动植物的病原菌。

1.3 链霉菌的性质和结构
理化性质：好氧菌，化能有机营养型，以好氧呼吸获取能量，营养要求低，能利用多种碳源，包括较复杂的纤维素，角蛋白和几丁质等，菌落致密，与基质结合较牢固，外观呈地衣状，皮革状或绒毛状，色彩丰富，其上长有大量粉状孢子，有的还会形成各种水溶性色素。

最适生长温度为25～35度；最适ph为6.5～8.0.
菌丝形态结构：G+,菌丝体发达，无分隔，以伸展在空间较粗的气生菌丝和较细，分枝，不会断裂的基内菌丝两种状态存在。

气生菌丝成熟后会分化成非轮生的孢子丝，孢子丝经横割分裂后产生大量孢子，孢子丝形态多样，有直形，波曲，钩状，盘卷和各种松紧不等的螺旋形等，孢子形状呈圆形，椭圆形，卵圆形和柱形等，表面为光滑或呈疣状，棘状或毛发状。

2 发酵菌种的选择和制备
2.1 菌种的选育
2.1.1 含微生物材料的选择
阿霉素主要由链霉菌（streptomyces)产生，该菌是最大的一群放线菌,属放线菌目,链霉菌属。

多数为腐生菌,好氧,革兰氏染色阳性。

有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。

孢子丝再形成分生孢子。

孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。

已报道的有千余种，主要分布于土壤中。

已知放线菌所产抗生素的90%由本属产生。

本次设计选择链霉菌属中的灰色链霉菌来作为菌种。

灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。

孢子量很多，呈椭圆球形。

气生菌丝和孢子都呈白色。

单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径约为3～4mm。

基内菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。

2.1.2材料的预处理
物理方法有加热，过滤，离心等，热处理通常可减少材料中的细菌数。

因为许多放线菌的繁殖体，孢子和菌丝片段比G-细菌细胞耐热。

提高pH进行培养。

化学方法是在养料中加1%几丁质培养用CaCO
3
出于实际和产品的GMP方面考虑，本实验采用化学方法。

2.1.3 所需菌种的分离
培养基，使用链霉菌优势培养基（在上边链霉菌比其他菌长的快），如：M
3
淀粉-酪素培养基中再加入4.6%(质量分数）的NaCl,其他微生物就有可能死亡或淘汰。

2.1.4 链霉菌的培养
本实验链霉菌最适生长温度为30℃，为嗜温菌，一般培养7～14天。

2.1.5 菌落的选择
本次设计采用铺菌法即：于分离平板上铺一层单一的试验菌的办法可用来测定各个菌落的阿霉素生产能力。

2.2 诱变育种
本实验利用紫外线（波长为233nm）辐射诱变方法从链霉菌菌株选育得阿霉素高产菌株，以提高阿霉素的发酵单位。

出发菌株：链霉菌属的灰色链霉菌，该菌株是生产抗生素的主要菌株，也产阿霉素，来源广，对诱导剂的敏感程度大，变异的幅度广，产阿霉素的发酵水平较高。

单细胞悬液的制备：在诱变育种中，采用生理状态一致的单孢子进行诱变，这样不仅可以使细胞或孢子均匀接触诱变剂，还可以避免分离现象的发生培养基，溶液和试剂：斜面培养基（g/L）：高氏一号培养基。

高氏一号培养基（g/l）:可溶性淀粉20，KNO
31，K
2
HPO
4
0.5，MgSO
4
0.5,FeSO
4
0.5,琼脂 20。

水：1000ml,PH 7.2～7.4。

（4）诱变处理
本设计采用紫外线诱变处理。

加入10ml无菌水于新鲜斜面培养物，用接种铲将菌丝刮下，用玻璃珠打碎成菌丝碎片，经一层滤纸过滤，制成菌丝悬浮液。

吸取5ml上述菌丝悬浮液于无菌培养皿中，置于波长为253.7nm、功率30W的紫外灯直下30cm处开盖、震荡照射60s。

（5）初筛与复筛
诱变处理后，正突变的菌株很少，所以要进行大量的筛选才能得到高产菌株，根据阿霉素生物合成途径和代谢调节理论，对阿霉素产生菌灰色链霉菌进行了推理选育，经多次紫外诱变才得到阿霉素的高产菌株，通过初筛和复筛，并确定最佳的发酵条件，才能使链霉菌的生产能力充分发挥出来。

选出阿霉素高产菌株。

2.3 菌种保藏
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少变异。

一般可通过保持培养基成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。

菌种常用
的保存的方法有斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。

综合考虑本次设计选用甘油菌丝冷冻保藏法，可使菌种保存1～2年左右还保存能产阿霉素的能力。

2.4 培养基的配置
分离纯化培养基：淀粉-酪素培养基。

诱变育种培养基：斜面培养基（g/L）：高氏一号培养基。

高氏一号培养基（g/l）:可溶性淀粉20，KNO
31，K
2
HPO
4
0.5，MgSO
4
0.5,FeSO
0.5,琼脂 20。

水：1000ml,PH 7.2-7.4。

菌种活化：将冷冻甘油管中的菌丝悬液或冻干管中的孢子洗出液转接于新鲜斜面培养基上，30℃下培养7～10天左右，转置于4℃冰箱保存备用。

种子培养基（g/L）：可溶性淀粉20,黄豆饼粉10，葡萄糖 20，棉籽饼粉 10，
MgS0
4·7H
2
0 2.5,KH
2
P0
4
0.5，NaCl 2； pH7.0。

发酵培养基（g/L）：可溶性淀粉70，ɑ-淀粉酶0.2，黄豆饼粉20，棉籽饼
粉20，(NH
4)
2
S0
4
1.5，MgS0
4
·7H
2
0 3.5，KH
2
P0
4
1.5，泡敌0.5； pH 6．7～7．0。

2.5 灭菌
所谓灭菌，就是利用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。

应用的范围有：①培养基的灭菌；②气体除菌；③设备及管道灭菌等。

工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。

在阿霉素的生产中，对培养基和发酵罐主要采用的是湿热蒸汽灭菌。

2.5.1 培养基的湿热灭菌的方法
在此阿霉素生产工艺中，年产5吨，用400m3发酵罐来发酵，故培养基采用连续灭菌。

其过程是将配置好的培养基在通入发酵罐是进行加热，保温，降温的灭菌过程，称为连消。

培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一般是130～140℃），短
时间保温后，被快速冷却，在进入早已灭菌完毕的发酵罐。

发酵罐在连续灭菌前先进行空罐灭菌，加热器，维持罐，冷却器也应先进行灭菌。

2.5.2 空气的除菌
在用链霉菌作为菌种发酵生产阿霉素的过程中，由于链霉菌是好氧微生物，所以制备无菌空气至关重要。

发酵用的无菌空气，就是将自然界的空气经过压缩、冷却、减湿、过滤等过程，达到以下标准：①连续提供一定流量的压缩空气。

②空气的压强（表压）为0.2～0.4MPa。

③进入过滤器之前，空气的相对湿度φ≦70%。

④进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10～30℃。

⑤压缩空气要有一定的洁净度。

空气除菌的流程图如下图2-1所示：
图2-1 空气除菌设备流程图
过滤是空气除菌的主要手段，按过滤介质孔隙将空气过滤器分为两类：绝对过滤，相对过滤。

绝对过滤如膜过滤等；相对过滤原理为：1惯性滞留作用，2拦截滞留作用，3布朗扩散作用，4重力沉降，5静电作用。

2.5.3 无菌空气的检测
现在采用的无菌实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法这里我们采用斜面培养法来检查。

具体方法如下：
380 mL三角瓶内装斜面培养基38mL,其组成为可溶性淀粉2％，黄豆饼粉
1％，K
2HP0
4
0．25％，NaCl 0.2％，MgS0
4
0．05％，CaC0
3
0．3％，琼脂1.8％，
pH 6.5～7.0，接种后置旋转式摇床，(30±1)℃下培养28h左右备用。

2.6 种子扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。

本发酵属于二级种子罐扩大培养，三级发酵。

种子制备的工艺流程如图2-2所示：
图2-2 种子扩大培养流程图
2.6.1 种子制备工艺
保藏在沙土管或冷冻干燥管中的菌种经无菌手续接入合适于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面，对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌落可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简单，不易污染杂菌。

对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的灰色链霉菌可以用摇瓶液体培养法。

孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。

2.6.3生产车间种子制备阶段
本设计的阿霉素发酵中采用二级种子罐扩大培养，三级发酵。

先将孢子悬浮液接入一级种子罐于30℃培养40h，此时孢子发芽，长出短菌丝，成为发芽罐；再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于30℃培养10～24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，称为繁殖罐。

此菌丝即可移到发酵罐作为种子。

2.6.4 影响种子质量的因素
影响种子质量的因素有原材料的质量，培养条件（温度、湿度、通气量）和斜面冷藏时间。

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。

原材料质量的波动，起主要作用是其中无机离子含量不同。

2.6.5 种子质量的控制措施
种子质量的控制可以通过菌种稳定性检查，无菌检查，保证原材料质量和控制培养条件等。

3 发酵工艺控制
3.1 发酵过程的补料策略
微生物发酵过程可分为：分批发酵、补料-分批、半连续（发酵液带放）和连续发酵。

分批发酵是一种准封闭式系统。

补料-分批发酵，即在分批发酵（一次性加入发酵罐内等发酵完全后放罐）的基础上，加入新鲜的料液，也克服由于养分的不足导致发酵过早结束。

连续发酵是在发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相近的流放速放料，维持发酵液原来的体积。

本设计采用半连续发酵，即在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液，放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。

补料过程：中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料，水等等，以满足微生物的代谢活动。

用两倍浓度的碳源的培养基补料，体积相当基础料的1/10，从培养12小时开始，每4小时补一次，分10次补加完，在过程中可添加磷酸二氢钾来调节pH。

3.2 温度对发酵过程的影响及控制
菌体的生长和合成抗生素的代谢活动都是在各种酶的催化下进行的，然而酶的催化作用需要有适当的温度。

从酶反应动力学来看，随着温度的升高，酶的活性加强，反应速率加大，生长代谢加快，抗生素分泌期提前，但温度过高，则酶易失去活性，菌体易迅速衰老，发酵周期缩短，抗生素产量就降低，因此维持产生菌的生长和合成抗生素所需要的最适温度是抗生素发酵的重要条件。

研究表明, 灰色链霉菌对温度敏感。

一般认为阿霉素发酵温度以30℃左右为宜。

3.3 pH对发酵过程影响及控制
灰色链霉菌对培养基中的碳源、氮源和营养物质的利用，造成培养基中有机酸或氨基氮的积累，会使pH值产生一定的变化，对阿霉素发酵生产有一定的影
响。

经过实验采用最佳培养基进行产阿霉素发酵条件研究。

设置了 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、6.1、9.0等7个初始pH的发酵培养基，实验结果表明，初始pH对菌体生长及阿霉素积累的影响较大，当初始pH为7.0或微碱时，对菌体生长和产阿霉素均是最有利，菌丝干重和阿霉素浓度分别达到。

当pH<7.0或>7.5时，菌丝干重和阿霉素浓度都有较大幅度地降低。

因此，发酵的pH初始值一定要控制在7.0或偏碱。

另外，因为阿霉素发酵的最适pH为7.0，所以本设计在发酵过程中也应严格控制pH为7.0左右，且上下浮动不超过0.5。

3.4 接种量对菌体生长及阿霉素积累的影响
接种量对发酵过程的影响很大，主要是影响菌体量，菌体的生长状态以及发酵液中溶氧状况，从而影响产酶。

分别考察2%、4％、6％、8％、10％的接种量对阿霉素的产量、菌体干重以及溶氧的影响。

实验结果得出，随着接种量的增大，菌体量增加迅速，接种量为10％时，在发酵到36h时，菌体量达到最大。

但接种量过大，发酵前期菌体大量繁殖，发酵液迅速变得粘稠，导致整个发酵体系溶氧水平下降，供氧不足，从而影响产量。

可见，接种量的选择对阿霉素的合成有着非常重要的影响，从发酵各参数考虑，选择10％的接种量较为合适。

3.5 无机盐对菌体生长及阿霉素积累的影响
无机盐是菌丝生长所必需的重要元素，能促进菌丝的生长，但在阿霉素的发酵中，过多的无机盐会形成大量无活性的阿霉素。

并且在发酵罐培养时还发现，在培养基中适当增加磷酸盐，可延缓菌丝衰老、自溶，减少发酵液的泡沫，可以改善发酵液的质量，有利提取过滤。

3.6 溶氧对发酵的影响及控制
阿霉素由链霉菌发酵产生，灰色链霉菌是一种高度需氧菌，发酵前期菌丝体大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出现一个低峰。

在生长阶段，产物合成期，需氧量减少，溶氧稳定，但受补料、加油等条件大影响。

补糖后，摄氧率就会增加，
引起溶氧浓度的下降，经过一段时间以后又逐步回升并接近原来的溶解氧浓度。

如继续补糖，又会继续下降，甚至引起生产受到限制。

发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度会明显上升。

在进行阿霉素工业化生产时，以此来确定发酵罐的通气量和搅拌功率。

3.7 发酵过程泡沫的控制
阿霉素发酵是好氧性发酵培养，发酵要通入大量的无菌空气，为了增加发酵培养基中溶解氧的浓度，还要进行搅拌，将大气泡打碎成小气泡。

同时，微生物发酵也会产生气体，从而在发酵液中形成大量气泡，培养基中含有大量的发泡性蛋白质，极容易产生泡沫，这就会使发酵液产生大量的泡沫。

本实验采取的措施为：除在基础料中加入1（g/l）泡敌外，还以（花生油：泡敌=5:1）作为混合消泡剂于发酵过程中滴加控制泡沫。

3.8 发酵终点的判断
判断放罐的指标有：产物浓度，过滤速率，菌丝形态，氨基氮，pH，DO,发酵液的年度和外观。

一般，菌丝自溶前总有些迹象，如氨基氮，DO和pH开始上升，菌丝碎片增多，黏度增加，过滤速率下降。

3.9 染菌的控制
在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量，重则倒罐，颗粒无收，严重影响工厂的效益。

因此要采取一些防治措施。

控制染菌可以通过降低培养温度，调整补料量，调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。

可能出现的异常发酵现象：
（1）培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏；
（2）培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染；
（3）耗糖较慢：可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；
（4）pH值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适；
（5）生长缓慢：最可能的原因就是营养成分不足。

一旦染菌根据染菌情况放灌或调节各种因素使发酵条件远离杂菌，例如：
1)．前期染菌，重新灭菌，补充新鲜培养液；
2)．中期染菌，偏离杂菌的生长条件；
3)．发酵后期染菌，提前放罐。

污染噬菌体常表现在发酵液变稀，DO迅速回升。

处理方法：灭菌放罐，清除生产环境，调换生产菌株，停产整顿（极其严重情况下），选育抗性菌。

因此，发酵过程应严格按照无菌操作的步骤进行杜绝染菌的发生。

4 发酵罐的工艺设计
4.1 发酵罐的结构
因为链霉菌属于放线菌，所以应采用好氧发酵设备。

本设计采用通用式发酵罐。

通用式发酵罐的主要组成部件有：
①罐体：发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是使液内充分湍流，使营养物质与菌体接触更充分，一般用4-6块挡板。

②搅拌装置：主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。

搅拌转速为200r/min.
③传热装置：有夹套，列管等，这里采用外夹套。

④通气部分：通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵罐通风量0-12 h为1：0.67vvm ,12 h至发酵结束通风量为1：（1.0-1.33）vvm 。

分布器有单管式和环形管式。

⑤消泡装置：用于消除产生的泡沫，最有效的控制泡沫的方式为添加消泡剂。

但是，由于消泡剂大多对菌体生长有抑制作用，故最常选用的简单实用的消泡装置是耙式消泡器，直接装在搅拌轴上，利用机械力量改变泡沫表面张力，达到消泡目的。

⑥进出料口：罐顶设有进料口，罐底有出料口。

其他附属设备还包括试镜、人孔、取样管等，用以观测和检修。

⑦管道系统，包括试镜、取样管、pH值探头、温度探头、溶氧探头等，用以随时观测、调节和检修。

发酵罐设备的结构图，见附图。

4.2 发酵罐的工艺尺寸
发酵罐大小用公称体积表示，V
0=∏D2×H
/4+0.15D3
其中：H
-发酵罐圆柱形筒身高度；D-发酵罐内径；
H-罐顶到罐底的高度；
d-搅拌器直径；
W-挡板宽度；
B-下搅拌器距罐底的距离；
S-搅拌器间距；
h-底封头或顶封头高度。

4.2.1 发酵罐的计算
年生产5吨阿霉素的生产日为260天，发酵周期为6天，清理及维修发酵罐总时间为1天，则发酵总时间为7天，产量为0.7g/L,发酵液预处理收率约为85%，提取时收率约为90%，浓缩干燥收率为95%，装料系数为70%。

一年需放罐的次数：260/7=37.1≈38次；
每批次产阿霉素：5000/38=131.6kg；
总提取率为：85%×90%×95%=72.675%；
假设用一台发酵罐，则发酵罐的体积V=131.6/0.7/72.675%/70%
=370m3
所以选用V0=400m3的发酵罐，则需发酵罐1个。

由V
0（公称体积）=V
a
（筒身容积）+V
b
（底部）≈∏D2H
/4+0.15D3得：
D=6.1m（H
=2.0D）；
那么：H
=2.0D=2.0×6.1=12.2m；
H=3D=3×6.1=18.3m；
d=D/2=0.5×6.1=3.05m；
W=D/12=6.1/12=0.51m；
B=0.9d=0.9×3.05=2.745m；
S=2d=2×3.05=6.1m；
h=D/4=6.1/4=1.525m；
液面高度H
L
=0.7(H+h)=0.7×(1.525+18.3)=13.88m。

本实验设计采取一个发酵罐，标准为400m3，发酵罐在一个发酵周期阿霉素产量为：
400×0.7×90%×85%×95%×0.7=142.443kg；
那么1个发酵罐1年的总产量为：
（142.443×260/7）×1=5290.74kg=5.3吨；
故符合年产量为5吨的生产要求。

4.2.2 发酵液组成物料衡算
400m3发酵罐的装料系数为0.7，则该罐的装料为：
400×0.7=280m3。

假设由于各种原因（如运输时等等）过程中损失0.5%，则实际用:
280/(1-0.5%)=281.4 m3；
因为发酵培养基（g/L）：可溶性淀粉70，ɑ-淀粉酶0.2，黄豆饼粉20，棉
籽饼粉20，(NH
4)
2
S0
4
1.5，MgS0
4
·7H
2
0 3.5，KH
2
P0
4
1.5，泡敌 0.5；计算如下：
38个批次时，400m3发酵罐的可溶性淀粉用量: 70×281.4×38=748524kg；38个批次时，400m3发酵罐的ɑ-淀粉酶用量: 0.2×281.4×38=2138.64kg；38个批次时，400m3发酵罐的黄豆饼粉用量：281.4×20×38=213864kg；38个批次时，400m3发酵罐的棉籽饼粉用量：281.4×20×38=213864kg；
38个批次时，400m3发酵罐的(NH
4)
2
S0
4
用量：281.4×1.5×38=16039.8kg；
38个批次时，400m3发酵罐的MgS0
4·7H
2
0用量：281.4×3.5×38=374262kg；
38个批次时，400m3发酵罐的KH
2P0
4
1.5用量：281.4×1.5×38=16039.8kg。

38个批次时，400m3发酵罐的泡敌用量：281.4×0.5×38=5346.6kg；
4.3 种子罐
种子培养基（g/L）：可溶性淀粉20,黄豆饼粉10，葡萄糖 20，棉籽饼粉 10，
MgS0
4·7H
2
0 2.5,KH
2
P0
4
0.5，NaCl 2。

种子罐培养的目的是使种子量增大，以缩短发酵罐的发酵延滞期。

单个种子罐的各组分用量，接种量都按10％计算：
（1）二级种子罐培养基的组分计算：
二级种子罐的装料系数0.7，所以装料为40×0.7=28m3。

假设由于各种原因（如运输时等等）过程中损失0.5%，则实际用: 28/(1-0.5%)=28.14 m3
40m3种子罐的可溶性淀粉的用量：28.14×20=562.8kg；40m3种子罐的黄豆饼粉的用量：28.14×10=281.4kg；40m3种子罐的葡萄糖的用量：28.14×20=562.8kg；
40m3种子罐的棉籽饼粉的用量：28.14×10=281.4kg；
40m3种子罐的MgS0
4·7H
2
0的用量：28.14×2.5=70.35kg；
40m3种子罐的KH
2P0
4
的用量：28.14×0.5=14.07kg；
40m3种子罐的NaCl的用量：28.14×2=56.28kg；
（2）一级种子罐培养基的组分计算：
由于种子罐规格可知，一级种子罐体积为4m3。

一级种子罐的装料系数0.6，所以装料为4×0.6=2.4m3。

假设由于各种原因（如运输时等等）过程中损失0.5%，则实际用: 2.4/(1-0.5%)=2.41 m3
4m3种子罐的可溶性淀粉的用量：2.41×20=48.2kg；
4m3种子罐的黄豆饼粉的用量：2.41×10=24.1kg；
4m3种子罐的葡萄糖的用量：2.41×20=48.2kg；
4m3种子罐的棉籽饼粉的用量：2.41×10=24.1kg；
4m3种子罐的MgS0
4·7H
2
0的用量：2.41×2.5=6.025kg；
4m3种子罐的KH
2P0
4
的用量：2.41×0.5=1.241kg；
4m3种子罐的NaCl的用量：2.41×2=4.82kg；
4.4 发酵罐搅拌装置
发酵罐上常用的搅拌器是推进式搅拌器和涡轮式搅拌器，这两种搅拌器各有特色：推进式搅拌器由于叶片的结构，物流流向主要为轴向，出物料量大，整体混合程度好，所需功率小，但剪应力较小，对气泡的细化和分散作用弱，在发酵中不利于氧的传递，因此涡轮式搅拌器被较大地应用于发酵罐中；但涡轮式搅拌器的功率消耗大，在相同的条件下，涡轮式搅拌器的功率消耗是推进式搅拌器的5～6倍。

根据阿霉素发酵工艺的需要，本设计采用六弯叶圆盘涡轮式搅拌器，可以有利于粉碎气泡，强化氧的传递，以达到最佳混合效果。

本设计采用六弯叶涡轮搅拌器，该搅拌器的各种尺寸与罐径D存在一定的比
例关系。

将主要尺寸列举如下：
搅拌器直径d=1/3D=1/3×6.1=2.8m；
叶宽b=0.2d=0.2×2.8=0.56m；
叶弦长L=0.25d=0.25×2.8=0.7m；
弧长r=0.375d=0.375×2.8=1.05m；
底距B=0.8D=0.8×6.1=6.8m；
盘经Φ=0.75d=0.75×2.8=2.1m；
叶距S=1.5d=1.5×2.8=4.2m；
弯叶板厚度δ=12mm。

4.5 发酵罐壁厚
δ1=pd/(2σψ-p)+C
式中: p:耐受压强（取0.25MPa）；
ψ: 焊缝系数，双面取0.8，无缝焊取1.0；
σ:设计温度下的许用应力（不锈钢焊接压力容器许用压力为150℃，137MPa）；
C:腐蚀裕度，当δ-C<10nm时，C=3nm。

δ1=pd/(2σψ-p)+C=0.25×6100/(2×137×0.8-0.25)+3=9.97mm；
=10mm。

取整为δ
1
4.6 封头壁厚
δ2=pDy/(2σψ)+C
式中：p:耐受压强（取0.25MPa）；
y:开孔系数，取2.3；
δ2=pDy/(2σψ)+C=0.25×6100×2.3/(2×137×0.8)+3=13.9mm；
δ2=14mm。

校核δ
≧0.15%D=9.15mm,所以该封头的名义厚度取14mm合适。

2
5 下游加工
5.1 下游加工过程
下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。

下游加工过程可分为4个阶段：
①发酵液的预处理和固液分离（加絮凝剂，加热，调节pH，离心沉降分离机等方法）；
②初步纯化（浓缩，吸附，离子交换，沉淀，萃取）；
③精制纯化(色层分离，结晶)；
④成品加工（干燥）。

5.2 阿霉素提取方法的研究
提取必须达到两个条件：一是纯度不低于92%，二是平均分子量也不能低于60万，因而阿霉素的提取技术涉及到两个方面，一是方法的合理性，主要表现在提取率，产品的纯度和分子量，提取过程是否对阿霉素的结构产生影响，从实验室到工业生产放大的可行性，以及操作是否方便，预、后处理是否复杂，对环境污染程度等。

二是过程的经济性，表现在提取成本，包括材料费用，能量消耗以及设备投资等。

5.2.1 阿霉素泡沫提取
泡沫分离法是针对表面活性物质进行分离的一种方法，非活性物质阿霉素与生物表面活性剂BSA主要通过疏水作用力和氢键结合，有较强的结合力，形成具有表面活性的复合物，从而实现牛血清蛋白泡沫提取阿霉素。

泡沫提取阿霉素的条件：
气流速度：气体是发泡的动力，其速度的控制至关重要。

BSA浓度的确定：BSA是生物表面活性剂，也是阿霉素的载体。