酶联免疫吸附试验的原理_操作方法及注意事项_李华林

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酶联免疫吸附（ELISA）试验具有灵敏性、特异性高，且重复性好，检测速度快的特点，尤其适合于大批量血清样品的检测，是国际认可的标准化诊断方法。

我国目前广泛应用该方法进行疫病流行病学调查和免疫抗体监测，评价疫苗免疫效力。

1基本原理
将抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

抗原或抗体再与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。

此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定。

由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

这就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性相结合，使ELISA方法成为既特异又敏感的检测方法。

2基本类型及用途
间接ELISA主要用于检测抗体，双抗体法用于检测大分子抗原，双夹心法用于测定大分子抗原，液相阻断ELISA用于测定抗体，竞争ELISA用于测定小分子抗原及半抗原，抗体捕捉ELISA法主要用于检测IgM抗体。

3操作方法
3.1间接酶联免疫吸附方法
间接法是检测抗体比较常用的方法。

主要是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

操作步骤如下。

将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加稀释的受检血清，其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。

其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

加酶标抗抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记酶。

洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

最后加底物显色，颜色深度代表标本中受检抗体的量。

酶标仪读数，对实验结果进行判定。

3.2液相阻断酶联免疫吸附方法
将预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，然后将抗原抗体复合物转移到包被了特异性抗体的ELISA板中，没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原就被ELISA板中的抗体捕获，于随后加入的豚鼠抗血清中的抗体结合，再通过兔抗豚鼠IgG酶结合物和底物溶液显色。

按试验孔呈现的颜色与抗原对照孔（未加血清）呈现颜色评定结果。

抗体滴度以能阻断50%病毒抗原的血清稀释度来表示。

具体操作步骤如下。

用包被缓冲液稀释的病原兔抗血清稀释至工作浓度，每孔加50微升，摇匀后封板，4℃过夜。

兔抗血清（Ab1）吸附在固相载体上，形成Ab1-。

抗原抗体（对照血清及待检血清）反应。

按试验要求稀释并加入对照和待检血清及抗原，封板，4℃过夜。

预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应，若被检血清中有特异性抗体，就与病毒抗原进行特异性结合。

用磷酸盐吐温缓冲（PBST）洗涤液洗ELISA板5次，在吸水纸上甩干。

将抗原抗体反应板各孔血清病毒混合液按次序转移至ELISA板上，每孔50微升，封板，37℃温育1小时。

没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA 板中的Ab1抗体捕获，形成Ab1-Ag-特异性结合物。

洗板后加入病原的豚鼠抗血清，每孔50微升，封板，37℃温育1小时。

洗板后，每孔加入50微升兔抗豚鼠IgG酶结合物，封板，37℃温育1小时。

洗涤后加
酶联免疫吸附试验的原理、操作方法及注意事项
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（1.宁夏吴忠市利通区动物疾病预防控制中心751100，2.宁夏吴忠市动物疾病预防控制中心751100，
3.宁夏吴忠市利通区动物卫生监督所751100）
作者简介：李华林（1966-），男，宁夏吴忠人，本科，高级兽医师，
主要从事动物疫病防控和实验室诊断检验及兽医临床工作。

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养殖技术顾问2011.6
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入酶标记的抗Ab2抗体，如兔抗豚鼠球蛋白Ab3，使之与Ab3发生特异性结合，结果形成Ab1-Ag-Ab2-Ab3-酶复合物。

洗板后，加入50微升邻苯二胺（OPD）底物液，37℃温育15分钟，每孔再加入50微升终止液。

洗涤后加入底物显色，呈现颜色的深浅与样品中的抗体含量成反比。

用酶标仪测定光密度（OD）值，加终止液后立即读数。

结果判定，只有符合试验认可标准结果才能成立。

当被检血清稀释孔OD值大于临界值为阳性孔，小于或等于临界值为阴性孔。

阳性孔所对应的稀释度就为该份血清的抗体滴度。

4注意事项
4.1试验前准备
洗板机在使用前后应使用蒸馏水冲洗管道，以保证洗板机各针孔畅通，否则个别板孔堵塞影响试验结果。

从试剂盒中取出本试验所用试剂，置室温平衡0.5~1.0小时。

以确保各试剂达到最好活性，从而使ELISA反应充分。

不要使用过期的试剂盒，不同批次试剂不能混合使用，以免影响试验结果。

4.2样本的采取与保存
采血时应尽量避免溶血。

制备血清标本时要采取自然凝固1~2小时，3000转/分钟，离心15分钟。

血清样本宜在新鲜时检测，结果比较准确。

若5天内检测，可使用冰箱2~8℃保存，超过1星期时间测定，应于零下20℃低温冻存。

反复冻溶会使抗体效价下降，所以检测抗体的血清标本如需做多次检测，宜少量分装冷冻保存。

4.3加样环节
样品稀释方法应严格按照使用说明书操作。

注意检查各孔液面高度是否一致，避免漏加、重复加液。

加样前先制作加样表，每板对应1个加样表，确保加样准确无误。

每次加样必须更换吸头，做到1个样品1个吸头，以免发生交叉污染。

每次加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，以免加样不准确，影响试验结果。

最好将试剂根据所需用量倒入加液槽中，防止试剂污染，严禁将加液槽剩余的试剂倒回试剂瓶中。

4.4温育环节
温育时间若人为延长，会导致非特异性结合紧附于反应孔周围，不能完全清洗干净，使试验结果不准确。

必须贴封片或加盖，按照说明严格控制操作温度和时间。

孵育时反应板均不宜叠放，以保证各板温度平衡一致。

孵育时尽量少开启恒温培养箱门，以保
证箱内温度，严禁缩短或延长孵育时间。

4.5洗涤反应板环节
ELISA试验是靠洗涤来达到分离游离和结合的
酶标记物。

酶联免疫吸附板每次洗涤要充分。

通过洗
涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合
的物质，以及在反应过程中非特异吸附于固相载体
上的干扰物质。

如果洗涤不充分，应该除去的杂质没
有洗掉，这样就会影响试验结果。

洗板时需保证微孔板平放，将洗涤液注满各孔，
尽量避免漏液、溢液现象。

配制洗涤液需要新鲜无污染的蒸馏水或去离子水，现配现用。

盛放洗涤液的容器应定期用清洁剂清洗，避免
长菌或其他污染。

每次洗完后要更换吸水纸轻轻拍干，同时避免
手指接触板底。

4.6显色和终止环节
显色是无色的底物生成有色产物的温育反应，
反应的温度和时间仍是影响显色的因素，要按说明
要求的温度和时间严格操作。

加入底物后应立即避光显色。

显色剂尽量在临
使用前配制，现配现用。

若底物呈现颜色变化则坚决
不能再用。

终止液是2克/摩尔的硫酸溶液，具有腐蚀性，
试验时要小心，避免损伤皮肤和衣物。

加终止液时，避免吸头和孔内液体接触，加液后
振动30秒，使底物与终止液充分混合再读数。

4.7酶标仪读数环节
使用前应先预热仪器15~30分钟，并调整到试
验要求的波长，使测定结果更稳定。

最好先擦拭微孔板底部并压平板条，避免反应
板底划痕、不平、指印或液面高度差异造成干扰，致
使读数结果不准确。

因此要保持酶标板干净，不能用
手触摸板底留下指印。

ELISA反应终止后需要在10分钟内读数，否则
影响实验结果。

因此，在ELISA试验实际操作中除了
选择优良仪器设备和试剂外，正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。

必须熟知试验
各个环节的注意事项，严格按要求进行实际操作，加
样时细心认真，严格按试验要求的时间和温度执行，
以严谨的工作作风检测每份标本，才能保证检验结
果准确无误。

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养殖技术顾问2011.6。