一种Taq DNA聚合酶活性测定方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911416831.6
(22)申请日 2019.12.31
(71)申请人 莫纳（武汉）生物科技有限公司
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新二路388号武汉光谷国际生
物医药企业加速器3.1期12号楼1-5层
(72)发明人 张坤晓　聂尚海　燕东平　
(74)专利代理机构 北京睿博行远知识产权代理
有限公司 11297
代理人 申超平
(51)Int.Cl.
C12Q 1/48(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)
(54)发明名称
一种Taq DNA聚合酶活性测定方法
(57)摘要
本发明提供了一种Taq DNA聚合酶活性测定
方法，所述方法包括如下步骤：(1)以不同浓度
lambda为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得
到lambda标准品浓度与荧光值的标准曲线；(2)
记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间
点下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双
链DNA量；(3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶
稀释倍数线性关系曲线；(4)Taq DNA聚合酶原酶
活性计算。

通过对同一时间点合成产物量与1/酶
稀释倍数线性关系的推演，计算得到Taq DNA聚
合酶活性，本发明的方法测定精确、反应快速、重
复性好。

权利要求书2页 说明书11页序列表1页 附图6页CN 111004834 A 2020.04.14
C N 111004834
A
1.一种Taq DNA聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以不同浓度lambda DNA为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得到lambda DNA标准品浓度与净荧光值的标准曲线；
(2)记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双链DNA量；
(3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系曲线；
(4)Taq DNA聚合酶原酶活性计算。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述lambda标准品的浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸染料包括PicoGreen饱和核酸染料。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体包括如下步骤：使用酶稀释缓冲液对待测Taq DNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR延伸的反应体系包括10×PCR缓冲液、MgCl2、模板、dNTP、核酸染料和Taq DNA聚合酶；
优选地，所述MgCl2的终浓度为2.0-3.0mM，优选为2.5mM；
优选地，所述模板的终浓度为1.125-1.5μM，优选为1.25μM。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酶稀释缓冲液包括10mM的Tris-HCl，0.1mM的EDTA·2Na，1mM的DTT和50％(v/v)甘油；
优选地，所述酶稀释缓冲液的pH值为8.5。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体包括如下步骤：根据步骤(2)所得不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点计算得到的新生成的双链DNA 量，绘制同一时间点下，以1/酶稀释倍数为横坐标，以合成产物量为纵坐标，得到线性关系曲线1，曲线1斜率即为合成产物量与1/酶稀释倍数的比值，即合成产物量与酶稀释倍数的乘积。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)具体包括如下步骤：根据步骤(3)中不同时间点下，合成产物量与酶稀释倍数的乘积作为纵坐标，以不同时间点为横坐标，得到线性关系曲线2，所述曲线2的斜率即为合成产物量×酶稀释倍数与不同时间点的比值，原酶活性＝酶活性×反应体系体积/原酶液体积。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)以100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL浓度的lambda DNA为标准品加入PicoGreen饱和核酸染料，记录荧光值，得到lambda DNA标准品浓度与荧光值的标准曲线；
(2)使用酶稀释缓冲液对待测Taq DNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后
进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量；
(3)步骤(3)具体包括如下步骤：根据步骤(2)所得不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点计算得到的新生成的双链DNA量，绘制同一时间点下，以1/酶稀释倍数为横坐标，以合成产物量为纵坐标，得到线性关系曲线1，曲线1斜率即为合成产物量与1/酶稀释倍数的比值，即合成产物量与酶稀释倍数的乘积；
(4)根据步骤(3)中不同时间点下，合成产物量与酶稀释倍数的乘积作为纵坐标，以不同时间点为横坐标，得到线性关系曲线2，所述曲线2的斜率即为合成产物量×酶稀释倍数与不同时间点的比值，原酶活性＝酶活性×反应体系体积/原酶液体积。

一种Taq DNA聚合酶活性测定方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化学领域，涉及一种Taq DNA聚合酶活性测定方法。

背景技术
[0002]Taq DNA聚合酶活性测定方法，如简便的普通PCR测定方法，即以对已知酶活和待测酶活的Taq DNA聚合酶进行倍比稀释，对同一模板进行扩增，检测扩增条带的灰度值，与已知酶活的对标品进行比较，进而计算出待测酶活的活性，该方法测定得到的酶活偏差较大，酶浓度偏差可高达2倍以上。

此外，国标给出的酶活测定和计算方法，即以lambda DNA为标准品绘制标准曲线，对待测酶活的Taq DNA聚合酶进行倍比稀释，进行PCR延伸，取延伸第8min对应的净荧光值，以此时的荧光值反推dNTP消耗量，从而计算酶活性，该方法测定酶活对数据准确定要求非常高，计算酶活有效数据点1-4个，极易导致因实验误差而无法计算出原酶活性或原酶活性计算偏差较大。

[0003]CN106987643A公开了一种Taq DNA聚合酶活性检测方法，该方法包括模板和引物的设计，PCR反应体系的配制、PCR反应条件的设置和TaqDNA聚合酶活性的准确计算。

但该方法给出的公式间接的限定了每一步获得数据的范围，当数据落在有效范围内，可以进行精确的计算，若数据未在有效范围内，则酶活计算失败，该方法计算酶活性的成功率太低。

[0004]因此，需要提供一种操作简便，数据分析准确的Taq DNA聚合酶活性测定方法。

发明内容
[0005]针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种Taq DNA聚合酶活性测定方法，通过对同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系的推演，计算得到Taq DNA聚合酶活性，本发明的方法测定精确、反应快速、重复性好。

[0006]为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本发明提供一种Taq DNA聚合酶活性测定方法，所述方法包括如下步骤：
[0008](1)以不同浓度lambda DNA为标准品加入核酸染料，记录荧光值，得到lambda DNA 标准品浓度与净荧光值的标准曲线；
[0009](2)记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点和不同模板浓度下得到的净荧光值，计算聚合反应新生成的双链DNA量；
[0010](3)绘制同一时间点合成产物量与1/酶稀释倍数线性关系曲线；
[0011](4)Taq DNA聚合酶原酶活性计算。

[0012]国标方法中对中间数据的高精度要求往往导致结果不稳定，无法测定酶活或误差较大，本发明通过增加数据监测点，扩大数据选择范围，配合严谨的逻辑推演，使得测定Taq DNA聚合酶活性的方法结果准确，反应快速，重复性好。

[0013]优选地，步骤(2)所述模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0014]本发明中模板为发夹型寡核苷酸，具体序列如SEQ ID NO.1所示：
[0015]5’-atgcaatcctgagaggacattagggACGAGCGGCGCCGGctatgcCCGGCGCCGCTCGT-3’. [0016]优选地，步骤(1)所述lambda标准品的浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL。

[0017]优选地，步骤(1)所述核酸染料包括PicoGreen饱和核酸染料。

[0018]优选地，步骤(2)具体包括如下步骤：使用酶稀释缓冲液对待测Taq DNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点下得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量。

[0019]优选地，所述PCR延伸的反应体系包括10×PCR缓冲液、MgCl2、模板、dNTP、核酸染料和Taq DNA聚合酶。

[0020]优选地，所述MgCl2的终浓度为2.0-3.0mM，例如可以是2.0mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM或3.0mM，优选为2.5mM。

[0021]优选地，所述模板的终浓度为1.125-1.5μM，例如可以是1.125μM、1.25μM、1.375μM 或1.5μM，优选为1.25μM。

[0022]以最优终浓度的配置方法为例，对T2干粉(即模板)加入溶解液溶解，母液浓度为100μM，加入0.25μl，反应体系终浓度为1.25μM。

[0023]优选地，所述酶稀释缓冲液包括10mM的Tris-HCl，0.1mM的EDTA·2Na，1mM的DTT和50％(v/v)甘油；。

[0024]优选地，所述酶稀释缓冲液的pH值为8.5。

[0025]优选地，步骤(3)具体包括如下步骤：根据步骤(2)所得不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点计算得到的新生成的双链DNA量，绘制同一时间点下，以1/酶稀释倍数为横坐标，以合成产物量为纵坐标，得到线性关系曲线1，曲线1斜率即为合成产物量与1/酶稀释倍数的比值，即合成产物量与酶稀释倍数的乘积。

[0026]优选地，步骤(4)具体包括如下步骤：根据步骤(3)中不同时间点下，合成产物量与酶稀释倍数的乘积作为纵坐标，以不同时间点为横坐标，得到线性关系曲线2，所述曲线2的斜率即为合成产物量×酶稀释倍数与不同时间点的比值，原酶活性＝酶活性×反应体系体积/原酶液体积。

[0027]优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[0028](1)以100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL和0.390625μg/mL浓度的lambda DNA为标准品加入PicoGreen饱和核酸染料，记录荧光值，得到lambda DNA标准品浓度与荧光值的标准曲线；
[0029](2)使用酶稀释缓冲液对待测Taq DNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液，然后进行PCR延伸，记录不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点得到的净荧光均值，根据步骤(1)得到的标准曲线计算相应的新生成的双链DNA量；
[0030](3)步骤(3)具体包括如下步骤：根据步骤(2)所得不同稀释倍数的Taq DNA聚合酶在不同时间点计算得到的新生成的双链DNA量，绘制同一时间点下，以1/酶稀释倍数为横坐标，以合成产物量为纵坐标，得到线性关系曲线1，曲线1斜率即为合成产物量与1/酶稀释倍数的比值，即合成产物量与酶稀释倍数的乘积；
[0031](4)根据步骤(3)中不同时间点下，合成产物量与酶稀释倍数的乘积作为纵坐标，
以不同时间点为横坐标，得到线性关系曲线2，所述曲线2的斜率即为合成产物量×酶稀释倍数与不同时间点的比值，原酶活性＝酶活性×反应体系体积/原酶液体积。

[0032]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0033]本发明的测定Taq DNA聚合酶活性的方法精确，反应快速，结果稳定，对中间数据的要求较低，降低对操作人员以及检测仪器精度的要求。

通过严谨的公式推导演算，确定Taq酶活性测定国标方法中的问题，提高模板用量，使扩增出现平台期的荧光值反映实际的酶活值，提高检测结果的准确性。

附图说明
[0034]图1为实施例中lambda DNA标准品浓度与荧光值的标准曲线；
[0035]图2为实施例中扩增194秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0036]图3为实施例中扩增227秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0037]图4为实施例中扩增261秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0038]图5为实施例中扩增294秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0039]图6为实施例中扩增328秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0040]图7为实施例中扩增361秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0041]图8为实施例中扩增395秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0042]图9为实施例中扩增462秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0043]图10为实施例中扩增495秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0044]图11为实施例中扩增529秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0045]图12为实施例中扩增562秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0046]图13为实施例中扩增596秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0047]图14为实施例中扩增629秒时合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系；[0048]图15为实施例中不同时间下合成产物量和酶稀释倍数乘积；
[0049]图16为实施例中对数增长期不同时间下合成产物量和酶稀释倍数乘积。

具体实施方式
[0050]为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

[0051]实验材料
[0052]发夹型寡核苷酸序列(Hairpin oligonucleotide sequence，Hairpin ONS)由苏州泓迅生物科技有限公司合成；
[0053]PicoGreen核酸染料(苏州宇恒生物科技有限公司)；
[0054]Taq plus DNA Polymerase(莫纳生物科技有限公司)。

[0055]实施例
[0056](一)Lambda DNA标准品体系配置
[0057] 1.配置1×TE溶液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA·2Na,pH＝8.5(25℃)；
[0058] 2.配置Lam bda DNA预染液：8.5μl 1×TE，1μl 10×PCR buffer，0.5μl PicoGreen；
[0059] 3.配置Lambda DNA标准品溶液：使用1×TE溶液对Lambda DNA标准品进行稀释至终浓度为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL，0.390625μg/mL；
[0060] mbda DNA标准品反应体系配置如表1所示。

[0061]表1
[0062] 实验组对照组
Lambda DNA预染液10μl10μl
Lambda DNA标准品溶液10μl/
1×TE溶液/10μl
[0063]注1：复孔4个；
[0064]注2：实验操作在4℃下进行。

[0065](二)待测Taq酶反应液配置
[0066] 1.配置10×PCR buffer：250mM Tris-HCl,50mM(NH4)2SO4,500mM KCl,1％(v/v) Tritonx-100，pH＝8.5(25℃)；
[0067] 2.配置MgCl2溶液：25mM；
[0068] 3.配置dNTP溶液：2.5mM；
[0069] 4.合成发夹型寡核苷酸序列(Hairpin oligonucleotide sequence，Hairpin ONS)，用ddH2O将T2干粉稀释至终浓度100μM；
[0070] 5.配置酶稀释缓冲液：10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA·2Na,1mM DTT,50％(v/v)甘油，pH＝8.5(25℃)；
[0071] 6.使用Taq DNA聚合酶稀释溶液对待测Taq DNA聚合酶进行2倍稀释，得到22-211的稀释液。

[0072]7.DNA聚合酶反应体系配置见表2.
[0073]表2
[0074]
[0075](三)反应程序
[0076]使用荧光定量PCR仪，荧光采集通道设置为：SYBR，程序74℃630s。

[0077](四)Lambda DNA标准曲线绘制
[0078]标准曲线方程为Y＝A+BX，其中X为La m bd a DN A标准品浓度(μg/m L)，
要求R2≥0.99.
[0079]不同标准品浓度对应荧光值的结果如表3所示。

[0080]表3
[0081]
[0082]
[0083]由表3的数据绘制标准曲线，结果如图1所示。

由图1可知，不同浓度标准品和荧光值的标准曲线为Y-0.0055+0.0059X，R2＝0.9996.
[0084](五)聚合反应新生成的双链DNA量的计算和同一时间点合成产物量与酶稀释倍数线性关系
[0085]聚合反应新生成的双链DNA量的计算：将不同时间点、不同Hairpin ONS模板量、不同稀释倍数Taq Plus DNA Polymerase下的荧光值酶带入标准曲线Y＝0.0055+0.0559X，计算出对应生成的双链DNA的量。

不同稀释倍数Taq Plus DNA聚合酶在不同时间点的净荧光值均值结果见表4.
[0086]表4
[0087]
[0089]由表4可知，当扩增时间达到194秒时，累积连续3-6个不饱和扩增稀释梯度taq酶对应的荧光值，可计算出有效地DNA合成量。

因此，自194秒起始，不间断地选取对数期增长的荧光值，计算相应的合成产物量，生成合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系。

[0090]1)扩增194秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表5所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图2所示。

[0091]表5
[0092]
[0094]2)扩增227秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表6
所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图3所示。

[0095]表6
[0096]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/220.3505445 6.19110412926391
1/230.1918125 3.34133752244165
1/240.056236250.90729353680431
1/250.01611050.186903052064632
[0097]3)扩增261秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表7所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图4所示。

[0098]表7
[0099]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/230.263131 4.62174147217235
1/240.09318725 1.57068671454219
1/250.02951150.427495511669659
1/260.0116520.106858168761221
[0100]4)扩增294秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表8所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图5所示。

[0101]表8
[0102]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/230.325656 5.74427289
1/240.13593725 2.338191203
1/250.0474140.748904847
1/260.017127250.205157092
[0103]5)扩增328秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表9所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图6所示。

[0104]表9
[0105]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/230.37601475 6.648379713
1/240.179256 3.115906643
1/250.06260275 1.021593357
1/260.02060850.267657092
[0106]6)扩增361秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表10所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图7所示。

[0107]表10
[0108]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/230.414049257.331225314
1/240.220633 3.858761221
1/250.07824975 1.302508977
1/260.02504550.347315978
[0109]7)扩增395秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表11所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图8所示。

[0110]表11
[0111]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/240.2593605 4.554048474
1/250.09485725 1.600668761
1/260.0286930.412800718
1/270.011886750.111072711
[0112]8)扩增462秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表12所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图9所示。

[0113]表12
[0114]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/240.322488 5.687396768
1/250.13079475 2.245866248
1/260.03975550.611409336
1/270.014419750.156548474
[0115]9)扩增495秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表13所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图10所示。

[0116]表13
[0117]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/240.3486855 6.157728905
1/250.15202475 2.62701526
1/260.04505550.706561939
1/270.0166280.196193896
[0118]10)扩增529秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表14所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图11所示。

[0119]表14
[0120]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/240.372448 6.584344704
1/250.16978225 2.945821364
1/260.0528530.846552962
1/270.01949350.247639138
[0121]11)扩增562秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表15所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图12所示。

[0122]表15
[0123]
[0124]
[0125]12)扩增596秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表16所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图13所示。

[0126]表16
[0127]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/240.4072037.208312388
1/250.20766475 3.625938061
1/260.0628855 1.026669659
1/270.022738250.305893178
1/280.00813350.043689408
[0128]13)扩增629秒时不同酶稀释倍数对应的荧光值以及计算得到的合成产物量如表17所示，合成产物量与1/酶稀释倍数之间的线性关系如图14所示。

[0129]表17
[0130]1/酶稀释倍数荧光值合成产物量
1/240.4216987.468545781
1/250.22766975 3.985094255
1/260.0694855 1.14516158
1/270.024140750.331072711
1/280.0089260.057917415
1/290.00227425-0.061503591
[0131]根据图2-14中的斜率，记录同一时间点合成产物量与酶稀释倍数线性关系，汇总结果如表18所示。

[0132]表18
[0133]
[0134]
[0135](六)Taq DNA聚合酶活性计算(合成产物量*酶稀释倍数与时间点线性关系) [0136]原酶活性＝合成产物量*(酶稀释倍数/时间)＝(合成产物量*酶稀释倍数)/时间。

[0137]以不同时间点作为横坐标，以合成产物量*Taq酶稀释倍数为纵坐标，绘制扩增曲线(图15)，计算处于对数期扩增曲线的斜率，即为酶活性。

[0138]由图15可知，194-550s为对数增殖期，选择对应散点作图，结果见图16.
[0139]由图16可知，合成产物量*酶稀释倍数对时间作图的斜率为酶活性，即0.3001μg/ ml/s。

根据Taq DNA Polymerase的酶活U的定义：74度30分钟用去10nmol dNTP，进行单位换算，换算过程如下：
[0140]0.3001μg/ml/s，μg与ng转换(×1000)得300.1ng/ml/s，ng与nmol转换(/324.5/2)得0.4624037nmol/ml/s，s与30min转换(/1800)得832.326656nmol/ml/30min，10nmol与U转换(/10)得83.2326656U/ml，管内20μl体系对应酶活性(×0.02)得1.66465331U，管内原酶体积0.25μl(/0.25)得6.65861324U/μl。

因此，Taq Plus DNAPolymerase活性为6.66U/μl。

[0141]对比例
[0142]前期研究显示，使用国标方法检测Taq酶活性时，计算的理论dNTP消耗量(nmol)应在0.024-0.166之间，Taq酶的稀释倍数应在4000-28571之间，λDNA荧光值范围在55001.3-1139172.7之间，才能计算出较为稳定的Taq酶活。

[0143]本对比例采用国标方法GB/T35542-2017对TAKARA公司的Taq酶进行检测，将待测酶进行2倍梯度稀释，稀释到的倍数依次为2^12＝4096，2^13＝8192，2^14＝16384，2^15＝32768，又补加了四个梯度：4096×1.5＝6144，8192×1.5＝12288，16384×1.5＝24576，32768×1.5＝49152，覆盖了Taq酶稀释倍数4000<D<28571。

第一次测定结果见表19. [0144]表19
[0145]
[0146]由表19可知，第一次检测的各稀释倍数对应的荧光值均不在55001.3-1139172.7的理论值范围内，若去除负值后继续代入公式y＝6429.8x+10626计算新生成的DNA双链的
量(x1)可得到两个有效数值3.916和1.255，进一步代入公式y2＝x1/(2×324.5)计算dNTP 消耗量(nmol)y2分别为0.0060和0.0019，最后代入公式S＝(y2+0.03)×D/0.24计算酶活S (U/mL)，结果显示，Taq酶稀释4096倍时酶活为615U/mL，稀释倍数为24576时，酶活为3267U/ mL.由于dNTP消耗量y2的数值均不在0.024-0.166之间，因此没有得到正确的酶活值。

[0147]鉴于第一次未能得到准确结果，故进行第二次重复试验，结果依然是净平均值都不在55001.3-1139172.7的范围内，最终计算得到三个稀释倍数对应的酶活值，4096倍时S ＝518U/mL，3072倍时S＝408U/mL，24576倍时S＝3141.2U/mL，由于y2的数值依然不在标准范围内，因此第二次测定也没有得到正确的酶活值。

[0148]调整待测酶的稀释倍数，进行第三次测定，测定结果见表20.
[0149]表20
[0150]
[0151]由表20可知，第三次检测得到三个有效值，分别为稀释16倍时S＝11U/mL，32倍时S ＝15U/mL，64倍时S＝20U/mL。

通过三次国标法测定Taq酶活实验可知，国标法对各个参数的范围要求严格，检测过程需要高度精确，整体方法的稳定性较差，不容易得到正确的酶活值。

[0152]经计算一个反应中dNTP的物质的量为2.5x10^(-3)x2x10^(-6)＝5x10^(-9)mol。

100μM T2干粉稀释液国标上原来的用量是0.1μl，这样T2的物质的量为100x10^(-6) x0.1x10^(-6)＝1x10^(-11)mol，T2发夹结构上的单链部分有25个bp，则单链碱基的物质的量为2.5x10^(-10)mol。

经公式推算λDNA与PicoGreen最大饱和结合量为18892.30ng/mL，双链碱基对的物质的量为18892.30ng/mL x10μl÷324.5＝5.822x10^(-10)mol。

所以国标上T2发夹结构的用量应增加5.822÷2.5＝2.3288倍，一个反应T2的用量应改为0.25μl。

这样T2的量才是过饱和的，当扩增出现平台期时的荧光值才能反映出实际的酶活值。

[0153]综上，本发明的方法克服国标法对精确度的要求，采用多个实验点，经过严谨的公式推导，可以显著提高Taq酶活测定方法的稳定性和结果的正确性。

本发明方法酶活计算准确、灵敏度高，微弱的Taq DNA聚合酶活性也可以被有效检测。

既解决了终点法的操作人为因素影响大的问题，也解决了荧光定量PCR检测法中受Taq酶活性的变化而影响检测准确性的问题。

该发明建立了Taq DNA聚合酶活性的检测标准，对数据进行充分分析，克服现有方法的主观性、随意性和酶活测定成功率低的问题。

[0154]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。

所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表
<110> 莫纳（武汉）生物科技有限公司
<120> 一种Taq DNA聚合酶活性测定方法
<130> OISZ18014
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> Nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<400> 1
atgcaatcct gagaggacat tagggacgag cggcgccggc tatgcccggc gccgctcgt 59
序　列　表1/1页CN 111004834 A
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图14
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图16说　明　书　附　图6/6页CN 111004834 A 21。