RP-HPLC同时测定附子地上部分中新乌头碱和次乌头碱的含量

RP-HPLC同时测定附子地上部分中新乌头碱和次乌头碱的含
量
刘少静;王小库;朱改改;杨黎彬
【摘要】Aim To develop an optimal RP-HPLC method for determining the content of mesaconitine and hypaconitine in the aerial part of Radix Aconiti Lateralis Praeparata. Methods Two constituents were analyzed simultaneously with a Venusil ABS C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) by gradient elution using acetonitrile-0. 1％ ethylenediamine as the mobile phase. The column was maintained at 30 ℃ . The flow rate was 1 ml . min -1. The detection wavelength was set at 230 nm. Results Excellent chromatographic separation was achieved for mesaconitine and hypaconitine. The linear ranges of the two constituents were 12. 5 ～ 1 200 mg · L-1 , and 11. 46 ～ 100 mg ～ L-1 respectivety. The extraction recoveries were 99. 72％ ( RSD = 0. 69％ ), and 100. 29％ ( RSD = 1. 07％ ) . Conclusion The method has the advantages of simplicity, acuteness and precision,which is suitable for quantitative analysis of mesaconitine, hypaconitine in Radix Aconiti Lateralis Praeparata.%目的建立RP-HPLC法,
测定附子地上部分中新乌头碱和次乌头碱的含量.方法采用Venusil ABS C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.1% 乙二胺溶液为流动相,梯度洗脱,柱温30 ℃,流速1 ml·min-1,检测波长230 nm.结果新乌头碱、次乌头碱均得到较好分离,分别在12.5～1 200 mg·L-1、11.46～1 100 mg·L-1呈良好的线性关系;加样回收率分别为99.72%(RSD=0.69%),100.29%(RSD=1.07%).结论该方法简便、灵敏、准确,可用于附子中双酯型生物碱的定量分析.
【期刊名称】《安徽医药》
【年(卷),期】2011(015)009
【总页数】2页(P1078-1079)
【关键词】附子地上部分;新乌头碱;次乌头碱;RP-HPLC
【作者】刘少静;王小库;朱改改;杨黎彬
【作者单位】西安医学院药学院,陕西,西安,710021;西安医学院药学院,陕西,西
安,710021;西安医学院药学院,陕西,西安,710021;西安医学院药学院,陕西,西
安,710021
【正文语种】中文
附子为毛莨科植物乌头Aconitum carm ichaeli Debx.的子根加工品。

其性大热、味辛、甘，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪之功效［1，2］。

药理研究表明:附子为常用中药，有止痛、强心、利尿、促进新陈代谢等作用［3，4］。

附子
的传统用药部位为根和根茎，地上部分弃之不用，造成严重浪费，因此有必要对附子地上部分有效化学成份进行研究，变废为宝。

附子中常见的有效成分为乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等生物碱［5，6］。

本研究建立了灵敏准确的RP-HPLC方法，对附子地上部分中的新乌头碱、次乌头碱进行定量分析，为附子地上部分的开发利用提供科学依据。

1.1 仪器 Agilent 1200系列高效液相色谱系统(包括在线脱气机，四元梯度泵，自动进样器，柱温箱和DAD二极管阵列检测器);FA1004B电子天平(上海越平科学
仪器有限公司);KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂对照品:次乌头碱(天津一方科技有限公司，纯度:99%);新乌头碱(天津一方
科技有限公司，纯度:99%)。

乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，水
为超纯水，其它试剂均为分析纯。

1.3 药材附子地上部分采自汉中洋县，由西安医学院中药教研室冯永辉副教授鉴定。

2.1 对照品溶液的制备分别精密称取新乌头碱和次乌头碱对照品适量，至10 ml
量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得新乌头碱和次乌头碱浓度分别为1 200、1 050 mg·L－1的混合对照品母液。

精密吸取一定量母液，加甲醇定容配制成系
列浓度的混合对照品溶液。

其中新乌头碱和次乌头碱浓度分别为:12.5、10.937 5 mg·L－1;25、21.875 mg·L－1;50、43.75 mg·L－1;100、87.5 mg·L－1;200、175 mg·L－1;400、350 mg·L－1;1 200、1 050 mg·L－1，4℃冷藏备用。

2.2 供试品溶液的制备取过40目筛的附子地上部分药材粉末约1.0 g，精密称定，置150 ml具塞锥形瓶中，加入浓氨水 2 ml，润湿 0.5 h，再加入甲醇 50 ml，密塞，静置过夜，超声(功率200 W，工作频率40 KHz)提取30 min，过滤，再以
10 ml甲醇分次洗涤药渣，过滤，合并滤液和洗液，40℃水浴挥干，甲醇溶解残渣，并定容至10 ml，摇匀，过0.45 μm微孔有机滤膜，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件色谱柱:Venusil ABS C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.1%乙二胺水溶液，梯度洗脱:0～ 17 min，56%乙腈;17.01 ～ 30 min，92%乙腈;检测波长:230 nm;柱温:30 ℃;流速:1.0 ml·min－1;进样量:10 μl。

色谱图见图1。

2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察精密吸取系列混合对照品溶液各10 μl，按照“2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。

以进样浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程。

试验结果详见表1。

2.4.2 精密度试验精密吸取对照品溶液10 μl，按照“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，测得新乌头碱和次乌头碱峰面积的RSD分别为0.45%、0.73%，结果表
明，该方法精密度良好。

2.4.3 重复性试验精密称取6份样品粉末各1.00 g，按照“2.2”项下方法制备供
试品溶液6份，按照“2.3”项下色谱条件，分别进样10 μl，测得新乌头碱和次
乌头碱峰面积的RSD分别为1.56%、1.87%，结果表明，该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别于0、2、4、8、12、24
h 进样测定。

结果新乌头碱和次乌头碱峰面积的RSD分别为1.37%、1.49%，结
果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验精密称取样品粉末3份，各约0.50 g，分别加入混合对照
品适量，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μl。

测得新乌头碱
的平均回收率为99.72%，RSD=0.69%;次乌头碱的平均回收率为 100.29%，RSD=1.07%，具体见表 2。

2.5 样品含量测定按照“2.2”项下方法制备供试品溶液3份，分别进样10 μl，
按照“2.3”项下色谱条件测定，结果见表3。

结果表明:三批附子地上部分中新乌
头碱含量较高，均值为5.89 mg·g－1，次乌头碱含量均值为3.37 mg·g－1。

3.1 色谱条件的优化
3.1.1 流动相的优化由于乌头类生物碱的碱性较强，为防止分离过程出现拖尾现象，需在流动相中加入一定改性剂以达到改善色谱峰形和提高分离度的目的。

本实验对乙腈-0.1%乙二胺、乙腈-0.1% 三乙胺、乙腈-40 mmol·L－1乙酸胺、乙腈-0.5%甲酸等五种流动相系统进行比较，最终确定乙腈-0.1%乙二胺水溶液作为流动相。

由于两种生物碱的极性差异，本实验采用梯度洗脱的方式进行分析。

综合考虑分离度、出峰时间及峰形等因素，调节流动相配比，最终采用0～17 min，56%乙
腈;17.01～30 min，92%乙腈进行梯度洗脱，可快速、准确地测定附子中两种生
物碱的含量。

3.1.2 检测波长的选择依据相关文献报道，本实验设置了240、235、232、230
nm等4个波长进行考察，并利用DAD检测器在200～400 nm扫描两种生物碱
吸收光谱。

结果表明:两种目标成分均在230 nm波长处有最大吸收，且噪音较小，基线平滑，具有较高的灵敏度，故选择230 nm作为检测波长。

3.2 样品提取工艺的考察以新乌头碱、次乌头碱的提取率为指标，本实验首先考
察了乙醚、乙醚-二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇等五种提取溶剂对提取效率的
影响。

结果表明甲醇的提取率最高，且峰形良好。

同时考察了甲醇用量(25、50、75 ml)、氨水用量(1、2、4 ml)、冷浸时间及超声时间对实验结果的影响，优选出的最佳提取方法为:1.00 g药材以2 ml浓氨水润湿0.5 h，再加50 ml甲醇浸泡过夜，超声提取30 min。

3.3 图1与表3分析比较图1中的对照品色谱图(A)和供试品色谱图(B)，可以看出:附子地上部分中乌头碱含量极低，未检出。

由表3可以看出:新乌头碱、次乌头碱
含量均较高，我们将进一步研究附子地上部分，对这两种生物碱的提取工艺进行深入研究。

【相关文献】
［1］简晖，董宁霞，郑晗，等.附子中3种双酯型生物碱的定量分析［J］.中草药，2008，
39(9):1413 －4.
［2］苏建树，刘白宁，田平芳，等.微生物发酵对川乌、附子中生物碱含量的影响［J］.北京化工
大学学报，2010，37(3):97 －101.
［3］项杰，王阳雪，侯大兵，等.反相高效液相色谱法测定附子有效成分含量的方法研究［J］.四
川大学学报:自然科学版，2006，43(1):165－9.
［4］刘岚，范智超，张志琪.HPLC同时测定成药中4种乌头类生物碱含量［J］.药物分析杂志，2010，30(2):236 －9.
［5］王瑞，刘芳，孙毅坤，等.不同附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱含量的 HPLC测
定［J］.药物分析杂志，2006，26(10):1361－3.
［6］邓雅琼，刘荣华，邵峰，等.反相高效液相色谱法测定附子中乌头碱等3种成分的含量［J］.
时珍国医国药，2009，20(5):1038－9.。