不同处理对动物线粒体DNA提取的影响

不同处理对动物线粒体DNA 提取的影响
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夏玉玲　张春霖　鲁　成ΞΞ(西南农业大学蚕学与生物技术学院,农业部蚕桑学重点实验室　重庆　400716)
摘　要 无脊椎动物[1]野桑蚕的蛹分别在不同温度下保存处理和用不同方法破碎新鲜蛹细胞处理,脊椎动物[1]长吻　的离体肝脏在不同试剂下保存处理。

经过处理后的材料分别再用改良的碱变性法[2～6]提取mtDNA ,并比较相应处理的mtDNA 。

研究发现:这几种处理的材料都能够将其mtDNA 提取出来,但不同处理的材料线粒体DNA 质量有所不同,提取动物线粒体DNA 时应根据实际需要处理材料。

关键词 动物　线粒体DNA (mtDNA )　提取　比较　处理
线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。

它是细胞进行氧化磷酸化的场所。

线粒体基因组不仅是研究DNA 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索。

动物线粒体DNA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[8～10]。

进行动物线粒体DNA 方面意义重大。

但是由于动物材料的来源往往受到一定的地域限制和一定的时间限制,为了尽量节省研究成本,如何获得较理想的材料是研究人员十分关注的问题。

目前,基本上都是采用动物的新鲜材料来提取线粒体DNA ,这无疑使实验带来诸多不便。

鉴于此,本文比较了用不同处理的材料提取的线粒体DNA 的质与量,从而提出如何保存材料以及注意事项等问题。

1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　野桑蚕　从陕西安康农校采集幼虫,让其发育到蛹期第三天后进行以下处理:新鲜材料、4℃冷藏1个月、-20℃冷冻1个月、-80℃冷冻1个月,提取时解冻。

1.1.2　长吻 从重庆北碚集贸市场买来杀鱼取肝脏,并进行以下处理:新鲜材料、福尔马林浸泡、无水乙醇浸泡,提取时用双蒸水洗净并用滤纸吸去多余的水分。

1.2　破碎细胞的方法
主要采用:⑴加STE 缓冲液直接研磨;⑵先加STE 缓冲液研磨成较细的碎片后转移至匀浆器中匀浆;⑶加STE 匀浆缓冲液直接在匀浆器中匀浆;⑷加STE 缓冲液在粉碎机中破碎。

以上的每个处理均取材料5g ,提取时按10ml STE 缓冲液/g 材料比例进行。

[11,12]1.3　线粒体的提取和鉴定和线粒体DNA 的制备、纯化
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第23卷　第1期2003年　3月 蚕　学　通　讯Newsletter of Sericultural Science ΞΞΞ通讯作者
国家自然科学基金项目(编号:30170719)、教育部基金项目(编号:02127)资助
参照廖顺尧[2]进行,稍作改进。

提取的整个过程保持在0～4℃低温,溶液和器皿均经高温高压灭菌。

1.4　浓度和纯度的检测
1.4.1　琼脂糖凝胶电泳　采用Mupid -2电泳仪电泳和B IO -RAD GEL DOC2000凝胶成像系统。

其中琼脂糖浓度为1.0%,电压为100V ,时间为40min 。

1.4.2　紫外分光光度计检测　采用B IO -RAD Smart spec TM3000分光光度计。

1.4.3　限制性内切酶酶切检测　用EcoRI 酶切电泳检测。

2　结果与分析2
.1　不同处理的野桑蚕线粒体DNA 获得情况比较
2.1.1　不同温度保存的野桑蚕mtDNA 的提取结果
表1　不同温度保存下野桑蚕mtDNA 样品的紫外吸收值
各种处理
A 260A 280A 260/A 280得率(μg )新鲜材料
0.2940.165 1.781 1.4704℃冷藏1个月
0.2170.125 1.737 1.085-20℃冷冻1个月
0.2610.121 2.161 1.305-80℃冷冻1个月0.2500.131 1.912 1.250
6蚕　学　通　讯 23卷
结合以上表1和图1、2,比较研究可知:新鲜材料获得的mtDNA 质量最好,4℃冷藏的材料在mtDNA 的电泳图上出现两条带,上方的条带较大。

-80℃冷冻的材料获得的mtDNA 质量较好,-20℃下冷冻的材料获得的mtDNA 质量相比较差。

新鲜材料固然很好,但是由于地域限制和时间限制等因素,很难获得特别理想的材料。

4℃下保存只能延缓活体的生长进程和尸体的腐败进程,短时间(一般为一周以内)是较为理想的保存方法。

但是时间久了,活体会出现冷死饿死、尸体腐败、细菌滋生等现象,再提取材料的mtDNA ,可能会引入新的DNA 污染,如细菌的基因组DNA (因为细菌的基因组DNA 也为环状双链,较mtDNA 为大,提取方法与mtDNA 基本相同),这正与本实验的结果相吻合。

野桑蚕保存于-20℃下冷冻1个月,其mtDNA 中A 260/A 280>2.0,电泳图还出现一条较浓的RNA 带,泳道出现了较明显的拖带,并且酶切不出清晰的条带来,由此可以说明这种处理的材料所获得的mtDNA 量少,有不同大小DNA 断片,可能还存在RNA 和基因组DNA 的污染。

如果要进行mtDNA 的RFL P 分子标记、克隆、测序或多态性分析等研究将不是理想的处理方法。

野桑蚕保存于-80℃下,其mtDNA 中A 260/A 280介于1.8～2.0之间,电泳图出现一条较浓的RNA 带,泳道出现了拖带,但酶切出较为清晰的条带来,由此可以说明这种处理的材料尽管所获得的mtDNA 量少,也有不同大小DNA 断片和RNA 、基因组DNA 的污染,但是与-20℃下冷冻相比其mtDNA 的质量要好得多,适合进行RFL P 、克隆、测序或多态性分析等研究。

2.1.
2　用不同破碎组织细胞方法破碎新鲜野桑蚕蛹mtDNA 样品比较
71期 夏玉玲等:不同处理对动物线粒体DNA 提取的影响
表2　不同细胞破碎方法野桑蚕mtDNA 样品的紫外吸收值
编号
各种细胞破碎方法A 260A 280A 260/A 280得率(μg )①
加STE 缓冲液直接研磨0.1850.113 1.6380.925②
先加STE 缓冲液研磨成较细的碎片弃蛹皮后,转移至匀浆器中匀浆0.2940.165 1.781 1.470③
加STE 匀浆缓冲液直接在匀浆器中匀浆0.1680.097 1.7340.880④加STE 缓冲液在粉碎机中破碎0.3040.143 2.131 1.520
结合表2和图3、4可以看出:用不同破碎组织细胞方法破碎新鲜野桑蚕蛹所获得的mtDNA 的质量有差别。

其中以先加STE 缓冲液研磨成较细的碎片弃蛹皮后,转移至匀浆器中匀浆的破碎方法最好,获得的mtDNA 质量最好,加STE 缓冲液直接研磨和直接在匀浆器中匀浆这两种破碎方法获得的mtDNA 质量较好,加STE 缓冲液在粉碎机中破碎组织细胞获得的mtDNA 质量最差。

破碎组织细胞是获取线粒体的一个关键步骤。

如果没有将细胞磨得足够细,那么线粒体就不能从细胞中释放出来,从而得不到线粒体,也就不能获得mtDNA 。

反之,如果磨得太细,可能会因为破碎细胞的同时也破碎了线粒体膜,从而在碱变性高盐复性的过程中很难除净核基因组DNA 的污染,也会因为破碎细胞的剧烈作用打断了线粒体DNA 和核基因组DNA ,致使在电泳检测时出现拖带。

分光光度计检测结果尽管浓度较高,但大部分是核基因组DNA 和RNA 的污染,所以这样获得的线粒体mtDNA 不能应用于酶切、RFL P 分子标记、克隆、测序等研究。

2.2　不同处理的长吻　线粒体DNA 获得情况比较
2.2.1
　不同试剂保存长吻　线粒体DNA 的获得情况
8蚕　学　通　讯 23卷
表3　不同试剂保存长吻　肝脏线粒体DNA 样品的紫外吸收值
编号
各项处理A 260A 280A 260/A 280得率(μg )①
新鲜材料0.4830.263 1.836 2.415②
无水乙醇浸泡1年0.3950.224 1.762 1.975③福尔马林浸泡1年0.3750.213 1.761 1.875
从表3和图5、6可知:新鲜材料获得的mtDNA 质量最好,在无水乙醇中浸泡1年后再提取材料的mtDNA ,其电泳结果和酶切结果都较好,只是相应的mtDNA 量减少了。

在福尔马林溶液中浸泡1年后再提取材料的mtDNA ,其电泳结果也较好,而且酶切结果叫无水乙醇更好。

由于很多材料不可能现取现用,特别是很多动物的离体组织,如果不能妥善保存,就可能丢失材料,甚至造成经济上巨大的损失,所以如何保存离体组织对研究很重要。

而通常采用的是福尔马林溶液和无水乙醇浸泡材料。

福尔马林溶液是一种防腐剂,浸泡的材料能够放置的时间较长,通常可以长达几年甚至几十年不变质,保存材料效果也较好。

但是从安全的角度来说,应该尽量少用或者不用福尔马林溶液。

因为福尔马林为无色透明液体,对皮肤和眼睛有强烈的刺激作用。

医学专家认为,福尔马林是一种慢性中毒药物,长期接触低剂量的福尔马林会引起慢性呼吸道疾病、女性月经紊乱、妊娠综合症,引起新生儿体质降低、染色体异常甚至鼻咽癌。

高浓度的福尔马林对神经系统、免疫系统、肝脏等都有毒害作用。

进入人体内的福尔马林危害还表现在它能凝固蛋白质,可使人致癌。

无水乙醇为无色澄明液体,易挥发,不同浓度的乙醇所具有的用途也不同。

其中消毒防腐是它的一个典型用途。

75%乙醇能进入细菌细胞内,杀死细菌。

含乙醇20%(V/V )的制剂也具有防腐作用,如另加入如甘油、挥发油等抑菌物质时,低于20%的乙醇也可起到防腐作用,在中性或碱性溶液中含量需在25%以上才能防腐。

本文采用无水乙醇可以使离体材料保存较长一段时间,只要材料中有无水乙醇存在,通常为几年,而且保存效果较好,且安全。

总之,用长期在无水乙醇和福尔马林溶液保存的离体材料提取的mtDNA 质量都较理想,只需根据保存时间需要来选择试剂即可。

3　讨论
本试验分别就野桑蚕在不同温度下保存、破碎组织细胞不同方法和鱼肝脏在不同试剂下保存等处理进行了研究比较,从而找到了用于线粒体DNA 提取的材料保存措施,并且得出用研磨和匀浆相结合的办法可以提高线粒体DNA 的质和量。

对非离体材料来说,将材料放置于-80℃下不仅可以保存很长一段时间,而且对材料本身的损害很小,这可能与它迅速冷冻不造成细胞破裂有关。

利用研磨和匀浆相结合的方法破碎组织细胞,可以减小离的损失,也可防止因剪切力过大而使线粒体膜破裂从而导致细胞中其它物质的污染。

对离体材料而言,将材料放置在无水乙醇中不仅安全而且并不影响线粒体DNA 的提取,是一种有效的保存方法,如果保存时间需要很长,也可以将材料放在福尔马林中浸泡,但一定要妥善存放,以免与人的长时间接触。

本实验对这几种处理作了一个初步分析,对于详细的影响以及作用机理还需要有待于进一步研究。

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1期 夏玉玲等:不同处理对动物线粒体DNA 提取的影响
01蚕　学　通　讯 23卷
参　考　文　献
1　朱弘复.动物分类学理论基础,上海:上海科技出版社,1987
2　廖顺尧.家蚕线粒体基因组序列测定、结构分析及其有关基因进化研究.西南农业大学1999届博士学位论文3　吴乃虎,王钢锋,阎景智,等.草鱼和鲤鱼线粒体DNA的分离纯化及其COI基因的分子克隆.动物学报, 1991,37(4):375～381
4　王文,施立明.一种改进的动物线粒体DNA提取方法.动物学研究,1993,14(2):197～198
5　Tamura K.Aotsuka T.Rapid isolation method of animal mitochondrial DNA by the alkaline lysis procedure.
Biochem.G enet.,1988,26(11/12):815～819
6　曹阳,唐仁天,刘良式,等.家蚕后部丝腺线粒体DNA的制备.遗传学报,1986,12(3):207-212
7　夏玉玲,刘彦群,鲁成.动物线粒体DNA提取的原理和方法.蚕学通讯,2002,22(3):24-29
8　郭荣昌主编.动物遗传学.北京:经济科学出版社,1997:19～20;380～382
9　黄原.分子系统学———原理、方法及应用[M].北京:中国农业出版社,1998,63～70;155～157
10　陈品健,陈小麟主编.动物生物学.北京:科学出版社,2001:30～32
11　陈毓荃主编.生物化学研究技术.北京:中国农业出版社,1995:9～24
12　欧阳平凯主编.生物分离原理及技术.北京:化学工业出版社,1999:25～60
EFFECTS OF DIFFERENT TREATMENTS ON
THE EXTRACTION OF MIT OCH ON DIAL
D NA OF ANIMALS
X ia Y uling　Zhang Chunlin　Lu Cheng
(College of Sericult ure and B iotechnology,Southwest A gricult ural U niversity;
The Key Sericult ure laboratory of the M i nist ry of A gricult ure,Chongqi ng400716,Chi na)
ABSTRACT
The pupae of Bombyx mandarina,an invertebrate,were stored under different tempera2 tures,or its fresh pupae were fragmented with different methods.The liver of L eiocassis lon2 gi rist ris,a vertebrate,was stored in different reagents.After such pre-treatments,the materi2 als were denatured by a modified alkaline lysis procedure and their mtDNA was extracted.The mtDNA of all the materials studied was successfully extracted,but its quantity and quality varied with treatments.It is concluded that the procedure adopted in the process of extracting animal mtDNA should be decided according to the materials used.
Key words animal　mtDNA　extract　comparison　treatment。