全版副溶血性弧菌标准的检验方法.doc

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副溶血性弧菌（Vibrioparahacmolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。

在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。

为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。

第一节副溶血性弧菌标准的检验方法
一、检验方法
（-）操作步骤
1. 分离培养：首先称取样品25g,加225mL3.5%火菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37°C8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37°C培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5%氯化钠三糖铁斜而，37°C、24h观察结果。

2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（匍萄糖产酸不产气）、上层斜而不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。

3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐腺水（0%, 3%, 7%, 10%）于37°C24h培养后观察生长情况，在无盐和10%盐的腺水中不生长，在3%和7%盐的丿冻水中生长良好者，继续进行下列有关试验。

4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，匍萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P,赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37°C培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，英他均在24h观察结果。

5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5%氯化钠淼水，经37°C、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL,观察2~3d,将死亡小鼠进行解剖作分离培养。

（二）检验程序
图6-1副溶血性弧菌检验程序
二、结果分析判宦及注意事项
（-）样品处理
采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。

对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复, 不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。

样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5%盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型別的大量细菌存在，以防漏检。

（二）形态与染色
为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、呱状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶
而有成对排列，一般大小为0.3~0.7umxl~2um,单端一根鞭毛，有动力, 运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。

（三）培养特性
在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长，在无盐的条件下不生长，在含2%~3%氮化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10%以上时不繁殖。

在肉汤和丿冻水等液体培养基中混浊生长，需氧性强，常在液体表而形成菌膜，在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。

在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。

在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上，有些副溶他性弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长，在0.7%以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛（侧毛）。

- 般在20~25°C培养生长的周鞭毛较为稳左，而在37°C培养或24h以上的培养物，周鞭毛易于由菌体自发脱落，具有周鞭毛的菌株，在固体培养基上多表现扩散生长，单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落，不表现扩散生长。

培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同，都能对扩散生长有所影响，菌落形态也容易受条件的影响有所改变，如在嗜盐性平板上一般生长良好，而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落，不易挑起。

在血平反上生长快可出现溶血环，在BCBS （硫代硫酸盐，柠掾酸盐，胆盐，蔗糖）和氯化钠蔗糖琼脂平板上，呈淡蓝或蓝绿色菌落。

一般由腹泻病人初期分离者多为典型菌落，长期保存的细菌或条件不适宜时，常有菌落变粗糙，形状不整齐或菌落出现解离，有的在液体培养时呈沉淀生长现象。

pH生长范用为5-10,最适pH为7.2~8.2,发育最适温度为30-37°C»
（四）生化特性
本菌对匍萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘需醇，产生靛基质，不产生硫化氢, 甲基红阳性，V-P 阴性，赖氨酸阳性，精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性，溶血性多数阳性，有少数不溶血，主要生物化学性状见表6-1。

近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步，逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识，对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。

表6J副溶血性弧菌的主要生物化学性状
项目项目
耐盐性0%-甲基红+
1%+V Ihp—
10%—靛基质+
術萄糖产酸+赖氨酸+
葡萄糖产气—鸟氨酸
—精氨酸—
甘露醇+溶血性+/_
硫化氢—
注：+阳性：一阴性：+/—多数阳性，少数阴性。

表6-2副溶血性呱菌与其他弧菌的鉴别
氧萄赖精鸟錠
明胶V!乳
甘
-廿阿拉
鼠
P半乳
盐
泳
蔗肌
菌名化糖产氨氨基露・“仏露李班H酸丄腺
液化P糠酹伯糖糖昔动气酸酸酸质糖糖盐水
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,%
0 6 8 10
副溶血性弧菌
+ + + + + ------ +一d+ + d —"4—v.paruhuemoly-ticus
溶藻弧菌
++++++ — + +++ F4d
v.alginolyicus
01霍乱弧菌
+++++ d (d) + +++ +—d —
v.choleraeoi
非5霍乱弧菌
+++++ d (d) + +d+ + d +d —
v.cholerae nonoj
拟态弧菌v.mimicus++ —+++一(d) 一 + ——+ +—4d —
河弧菌v.fluialis+ d+—d+_ _ + +_ + d d+ ++4d 创伤弧菌u r
+++++—+ d d++ +——d —idnificus
梅氏弧菌
d +d++ d +亠d d d——d —v.metschnikouii
霍利斯弧菌
++_ +++—d —v.hollisae
v.damsela—— d +———+ ------------------- ——++——d —注：+90%以上为阳性：一90%以上为阴性：（+ ）迟缓阳性：d 11%~89%为阳性；（d） 11-89%迟缓阳性。

（五）溶血性试验
我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限泄的条件下培养副溶血性弧菌时岀现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。

此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37°C、24h培养，如在单个菌落周由呈现透明溶血环或在菌落下而有明显溶血者，为“神奈川现象“阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象'阴性。

有致病性的副溶他性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。

（六）动物试验
经上述检验的可疑菌株，用小鼠测左毒力，将16~18h的蛋白腺水或肉汤培养物，注射小鼠腹腔O.3~O.5mL,有毒力者可在5~10h发病死亡，长者有24h左右发病死亡。

发病时有竖毛、运动不活泼，腹部紧贴罐底，呼吸困难，四肢抽搐、尾部痉挛震颐等症状。

将死亡小鼠解剖后，取心血等内脏进行分离，可检岀试验菌的纯培养。

对照动物观察2~3d无异常现象。

但应注意，尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡，有时不易区别，需要上述毓的检验后，进行毒力证实，综合判泄结果。

三、培养基
（-）氯化钠结晶紫增菌液
成分：蛋白腺20g
氯化钠40g
0.01%结晶紫溶液5mL
蒸例水lOOOmL
pH9.0
制法：除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加3%氢氧化钾溶液4.5mL,校正pH, 加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管，121°C髙压灭菌15min。

（二）氯化钠慝糖琼脂
成分:蛋白腺10g
牛肉膏10g
氯化钠50g
蔗糖10g
琼脂18g
0.2%渎聯香草酚蓝溶液20mL
蒸锢水lOOOmL
pH7.8
制法：将牛肉膏.蛋白丿I东及氮化钠溶解于蒸憎水中，校正pH,加入琼脂，加热溶解，过滤, 加入指示剂，分装烧瓶100mL, 121°C高压火菌15min备用。

临用前在100mL培养基内加入蔗糖lg,加热溶化，冷至50°C倾注平板。

蛋白淼20g
氮化钠40g
琼脂17g
0.01%结晶紫溶液5mL
蒸饬水lOOOmL
（三）嗜盐菌选择性培养基
成分:
制法：除结晶紫和琼脂外.其他按上述成分配好，校正pH,加入琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶100mL。

（四）3.5%氯化钠三糖铁琼脂
成分：贵白淼20g
pH8.7
牛肉膏5g
乳糖10g
蔗糖10g
葡萄糖lg
氮化钠35g
硫酸亚铁钱0.2g
硫代硫酸钠0.2g
琼脂12g
酚红O.O25g
蒸锢水lOOOmL
pH7.4
制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸憎水中，校正pH,加入琼脂，加热煮沸使琼
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脂溶化，加入0.2%酚红溶液12.5mL,摇匀,分装试管,12KC 高压灭菌15min,放置高层 斜面备用。

（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）
成分：酵母膏
3g 蛋白腺 10g 氯化钠 70g 磷酸氢二钠 5g 甘露醇 log 结晶紫 0.00 lg 琼脂
15g 蒸锢水
I OOOmL
制法：调pH8.0,加热30min （不必高压人待冷至45°C 左右时，加入新鲜人或兔血（5%~10% ）, 混合均匀，倾注平皿。

（六）嗜盐性试验培养基
pH7.7
（七）3.5%氯化钠生化试验培养基
成分：牛肉膏
5g 蛋白腺 10g 氯化钠 35g 磷酸氢二钠
2g 0.2%渎粘香草酚蓝溶液 12mL 蒸锚水
1
OOOmL
pH7.7
制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，匍萄糖发酵管可按0.5% 匍萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121°C 高压灭菌15min o H 他培养基可分装为每瓶 lOOmL,
12KC 高压灭菌15min,另将各糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌后,取5mL 糖液，加入100mL 培养基内，以无菌操作分装小试管。

（八）窗萄糖食盐陈水（MR-VP 试验用）
成分：多腺
5g 葡萄糖 5g
磷酸氢二钾5g 氮化钠
30g 制法：加入1 OOOmL 蒸懈水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121°C 髙压火菌
15min o
（九）食盐腺水（靛基质试验用）
成分：蛋白腺
20g
成分：蛋白淼
氯化钠
蒸锢水
2g
按不同址加入 100mL
30g lOOOmL
pH7.4
制法：按上述分配制,分装小试管,12KC 高压灭菌15min<> （十）运动性试验培养基
成分：牛肉膏
3g
蛋白腺 10g 氯化钠 30g
琼脂
4g
制法：将全部成分加入lOOOmL 蒸镭水，加热溶解，分装试管，12「C15min 髙压灭菌，最 终
pH7.4«
第二r ；副溶血性弧菌参考检验方法 一、日本食品微生物检验方法 （一）分离、菌数测泄
图6・2分离、菌数测定程序 （二）鉴定
将TCBS 平板上生长典型或可疑的菌落挑取2个以上，接种以下培养基:
图6・3鉴左程序 （三）检査用培养基
1.3%氯化钠蛋白丿冻稀释液：蛋白腺10g 、氯化钠30g 溶于lOOOmL 蒸餾水中，校正pH7.O, 12rC15min 髙压灭菌。

2. TCBS
成分：酵母膏
5g 蛋白淼 10g 蔗糖 20g 硫代硫酸钠 10g 柠愫酸钠
10g
牛胆酸钠
3g 氯化钠 蒸锢水
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牛胆汁粉5g
氯化钠log
柠朦酸铁lg
渙略香草酚蓝（2%溶液）20mL
草酚蓝（1%溶液）4mL
琼脂15g
pH8.6
制法：将上述成分加蒸餾水至lOOOmL,混合，使全部溶解，校正pH为86加热煮沸，不需高压灭菌，倾注平皿15~20mL。

不分解蔗糖的副溶血性弧菌，在此培养基上生长呈蓝绿色菌落，分解蔗糖的细菌呈黄色菌落。

3.我妻氏琼脂（改良）培养基
成分：酵母膏5g
蛋白淼10g
氯化钠70g
廿靈醉5g
结晶紫（0.1%酒精溶液）ImL 琼脂15g
制法：将全部成分溶于1000mL蒸馆水中，调正pH为7.5,至完全溶解后，加热煮沸数分钟，不需高压火菌，冷却至50°C时，加入洗净的20%浓度的人红血球悬液lOOmL,混合均匀后倾注平皿。

红血球悬液的制备：将人的脱纤维血液，离心沉淀的血球，用0.85%火菌生理盐水洗3次, 最后沉淀的红血球，用生理盐水制成1:4的悬液。

4 •亚硫酸钮肉汤
成分：蛋白淼log
氯化钠25g
氮化钾0.7g
氯化镁5g
制法：加蒸餾水950mL溶解，调pH为9.h 12KC高压灭菌15miib室温冷却，加亚硫酸钮溶液100mL及95%洒精ImL,混匀，无菌手续加入火菌试管，每管100mL,不需加热。

亚硫酸钮溶液配制：①热水100mL,加亚硫酸钠20g：②热水100mL加柠檬酸W O.lg；③将①加②溶解甘露醇20g,煮沸lmin,最终成白色混浊的混合物，使用前摇匀。

于冷库贮存，可使用1个月。

5. 食盐碳水化合物肉汤基础液
成分：蛋白腺2g
硫酸钠 2.5g
氮化镀5g
磷酸二氢钠0.5g
磷酸氢二钠 1.5g
0.2%渎聃香草酚蓝溶液12mL
制法：将全部成分溶于1000人工海水中，分装试管，每管5mL, 121°C15min高压灭菌，冷却后分别加碳水化合物10%灭菌溶液0.5n】L。

碳水化合物溶液需过滤或115ri0min高压火菌。

人工海水的配制：氯化钠23.4g,氯化钾0.66g,硫酸钠3.91g,重碳酸钠0.19g,氯化镁4.96g, 将上述
全部成分溶于1000mL蒸憾水。

6. Hugh-Leifson食盐培养基
成分：贾白腺2g
氮酸钠30g
磷酸氢二钾0・3g
葡萄糖10g
琼脂4g
0.2%渎翳香草酚蓝溶液12mL
蒸锚水lOOOmL
pH7.4
制法：将上述成分溶解，调pH后加指示剂，分装试管,每管3mL, 121°C高压灭菌15min。

试验方法：穿刺接种两种，一管加矿物油覆盖表面，于35~37°C培养，两管同时变黄为葡萄糖发
酵，只有不加矿物汕的培养管变黄时为葡萄氧化。

二、耐热溶血毒检验方法
根据试验证明，神奈川现象阳性菌株，多数对人的致病性有密切关系，神奈川现象的阳性物质
称“耐热性溶血素”，检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒，可参考下述方法：
（一）Sahuria （櫻井氏）法
用副溶他性弧菌肉汤培养物上淸液为抗原,与制备的精制耐热性溶血毒的抗血淸进行琼脂扩散试验，观察沉淀线。

（二）Eick法（本田改良法）
以微研No.l琼脂（Difco腺30g，磷酸氢二钠30g,氯化钠40g,葡萄糖5g,琼脂15g,蒸馆冰1000mL, pH7.3）培养37°C过夜，在平板上菌落旁约为5mm处放一小滤纸片（上吸有抗血淸），室温放一夜，观察滤纸旁有无沉淀红。

（三）液体培养检验法（饭田民）
用2%氯化钠肉汤，加入少虽新鲜红血球，倾斜培养，神奈川现象阳性菌株能引起溶血，而阴性菌株不溶血。

（四）反相被动血球凝集法（太田氏）
用吸附抗体的红血球测定抗原（溶血毒），此方法极为敏感，可查岀微量耐热性溶血毒。

并发现神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。

三、至病性试验方法
（-）兔肠禅结扎试验
选用正常健康家兔，首选使家兔断食24h,用乙礎麻醉，将腹壁切口，露出小肠，选取肠段约5cm 左右，于两端结扎，注入检菌的肉汤培养物，同时另选两段作阳性和阴性对照，然后迅速缝合，24h后由耳静脉注入空气杀死，开腹检査，有致病性者注菌肠段可见肿胀积液,
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出现坏死现象。

一般认为神奈川现象阳性菌株，兔肠祥结扎试验多数为阳性反应，神奈川现象阴性菌株多数为阴性，但亦有少数为阳性者。

（二）新生兔经口试验
选用1~2日龄的新生家兔，将检菌的培养物经口喂入l~2n】L,有致病性者一般可在10~20h 发病，初期症状蜷缩不动，随后呈极度疼痛状，翻滚嚎叫，呼吸急促，痉挛，多数在24h 左右死亡，解剖可见内脏充血现象。

无毒株不发病，可对致病性副溶血性弧菌与非致病性溶藻弧菌进行鉴别。

四、血清学检验
进行副溶血性弧菌血淸学鉴左时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3%食盐水作成较浓的菌悬液，121°C髙压lh或100°C煮沸后，用此菌悬液进行O抗血淸玻片凝集试验, 同时用无菌生理盐水作对照，如O凝集反应阳性时，可用不经加热的菌悬液进行K抗血淸玻片凝集反应分型判定。

副溶血性弧菌有三种抗原，即0抗原（菌体抗原），K抗原（荚膜抗原）及H抗原（鞭毛抗原），日本淤川氏和坂崎氏，根据对本菌血淸学特性的研究，经逐年的进展，将副溶血性弧菌分出11个O群，60个K型，63个血淸型。

关于II抗原，因与其他弧菌有共同性，至今在血淸型别的分类上没有利用。

副溶血性弧菌的抗原组合见表6-3.
表6-3副溶血性呱菌的抗原组合
0群k型
11,25,26, 32, 38, 41, 56
23,
28
34化5. 6. 7. 29, 30S 3L 48,9, 10, 1L 12. 13,
515.17,30 \ 47, 60, 61 6
18,46
719
8
20,21.22, 39, 62
923.44
10⑼24.53
1136,40,50. 51,58\ 64
34, 42. 49. 53, 55, 63
总计11 60k型/63血清型
33, 37, 43, 45, 48, 54, 57, 58 a, 59。