染色法、培养基和(微生物检验)试剂配制作业指导书

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染色法、培养基和（微生物检验）试剂配制作业指导书
1 目的
对染色法、培养基和试剂配制方法作出明确规定，为检测结果的准确性提供最基本的保证。

2 范围
适用于微生物检验。

3 职责
3.1微检人员负责培养基、试剂配制。

3.2微检人员掌握微生物的染色方法。

4 培养基和试剂配制名称、用途
5 具体内容
5.1革兰氏染色法
5.1.1革兰氏染色液
5.1.1.1结晶紫染色液
成份：结晶紫 1.0g
95%乙醇20.0ml
1%草酸铵水溶液80.0ml 5.1.1.2革兰氏碘液
成份：碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水300.0ml
5.1.1.3 95%乙醇
5.1.1.4沙黄复染液
成份：沙黄0.25g
95%乙醇10.0ml
蒸馏水90.0ml
5.1.2染色法
5.1.2.1将涂片在火焰上固定。

5.1.2.2初染：滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

5.1.2.3媒染：滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。

5.1.2.4脱色：滴加95%乙醇脱色，水洗；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。

5.1.2.5复染：滴加沙黄复染液，染1min，水洗，待干，镜检。

5.1.2.6结果判定：革兰氏阳性菌呈紫色；革兰氏阴性菌呈红色。

5.2一般培养基和专用培养基
5.2.1营养琼脂
5.2.1.1用途：用于一般细菌培养及细菌总数测定。

5.2.2.2成份（g/L）：
蛋白胨10.0
牛肉粉 3.0
氯化钠 5.0
琼脂15.0
PH7.3±0.1
5.2.2.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15 min
高压灭菌备用。

5.2.2.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.2孟加拉红培养基
5.2.2.1用途：用于粮食、食品、饮料中霉菌、酵母菌计数。

5.2.2.2成份（g/L）：
蛋白胨 5.0
葡萄糖10.0
磷酸二氢钾 1.0
硫酸镁0.5
孟加拉红0.03
氯霉菌0.1
琼脂15.0
5.2.2.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃20 min 高压灭菌备用。

5.2.2.4注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。

5.2.3乳糖胆盐发酵管
5.2.3.1用途：用于大肠菌群，粪大肠菌群及大肠杆菌的测定。

5.2.3.2成份（g/L）：
蛋白胨20.0
胆盐 3.0
乳糖 5.0
溴甲酚紫0.01
PH7.4±0.1
5.2.3.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，115℃15min高压灭菌，双料乳糖胆盐发酵管除纯水外，其它成份加倍。

5.2.3.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.4乳糖复发酵管
5.2.4.1用途：供大肠菌群证实试验用。

5.2.4.2成份（g/L）：
蛋白胨20.0
乳糖10.0
溴甲酚紫0.01
PH7.4±0.1
5.2.4.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装10ml于有倒立发酵管的试管中，115℃15min高压灭菌备用。

5.2.4.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.5三糖铁琼脂
5.2.5.1用途：主要用于肠杆菌科细菌的生化反应筛选。

5.2.5.2成份（g/L）：
蛋白胨20.0 酚红0.025
牛肉膏 3.0 氯化钠 5.0
乳糖10.0 硫酸亚铁铵(6H2O) 0.5
蔗糖10.0 硫代硫酸钠0.5
琼脂12.0 葡萄糖 1.0
PH7.4±0.1
5.2.5.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至溶解，分装试管，115℃15min 高压灭菌制成高层斜面备用。

5.2.5.4注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。

5.2.6伊红美兰琼脂
5.2.
6.1用途：弱选择性培养基，用于分离肠道致病菌。

5.2.
6.2成份（g/L）：
蛋白胨10.0
乳糖10.0
磷酸氢二钾 2.0
琼脂15.0
伊红0.4
美兰0.065
PH7.1±0.2
5.2.
6.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热溶解，121℃15min高压灭菌，冷至55℃倾注平板备用。

5.2.
6.4注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。

5.2.7缓冲蛋白胨水
5.2.7.1用途：用于沙门氏菌检验中的前增菌。

5.2.7.2成份（g/L）：
蛋白胨10.0
氯化钠 5.0
Na2HPO4(12H2O) 9.0
KH2PO4 1.5
最终PH7.2±0.1
5.2.7.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每瓶225ml，121℃15min高压灭菌备用。

5.2.7.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.8四硫酸钠煌(TTB)绿增菌液
5.2.8.1用途：用于沙门氏菌检验中前增菌。

5.2.8.2成份（g/L）：
A基础培养基
多胨或胨 5.0g
胆盐 1.0g
碳酸钙10.0g
硫代硫酸钠30.0g
蒸馏水1000ml
B碘溶液
碘 5.0g
碘化钾 6.0g
蒸馏水20ml
5.2.8.3制法：将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100 ml。

分装时应随时震荡，使其中的碳酸钙混匀。

121℃高压灭菌15min备用，临用时每100 ml基础培养基中加入碘溶液2 ml、0.1%煌绿溶液1 ml。

5.2.8.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.9GN增菌液
5.2.9.1用途：用于志贺氏菌的前增菌液
5.2.9.2成份（g/L）：
胰蛋白胨20.0 g
葡萄糖 1.0 g
甘露醇 2.0 g
柠檬酸钠 5.0 g
去氧胆酸钠0.5 g
磷酸氢二钾 4.0 g
磷酸二氢钾 1.5 g
氯化钠 5.0 g
蒸馏水1000ml
5.2.9.3制法:按上述成分配好，加热使溶解，校正pH。

分装每瓶225 ml，115℃高压灭菌15min。

5.2.9.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.10亚硒酸盐胱氨酸增菌液
5.2.10.1用途：用于沙门氏菌选择性增菌培养。

5.2.10.2成份（g/L）：
蛋白胨 5.0
乳糖 4.0
磷酸氢二钠10.0
亚硒酸氢钠 4.0
L-胱氨酸0.1
PH7.0±0.1
5.2.10.3制法: 称取各成份溶于灭菌纯水中，在无菌容器中溶解，分装，每瓶100ml，
备用。

5.2.10.4注意事项：于4℃冰箱中密封保存。

5.2.11 SS琼脂
5.2.11.1用途：用于沙门氏菌、志贺氏菌的分离。

5.2.11.2成份（g/L）：
蛋白胨 5.0 牛肉粉 5.0
乳糖10.0 三号胆盐 3.5
柠檬酸铁10.0 柠檬酸钠8.5
中性红0.025 硫代硫酸钠8.5
琼脂15.0 煌绿0.00033
PH7.0±0.1
5.2.11.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸溶解，冷至55℃，倾注平板备用。

5.2.11.4注意事项：A保存于阴凉干燥处，密封、避光。

B勿高压灭菌。

5.2.12V-P半固体琼脂
5.2.12.1用途：用于细菌检验的V-P试验。

5.2.12.2成份（g/L）：
蛋白胨12.0
酵母膏 1.0
葡萄糖10.0
氯化钠 5.0
琼脂 3.0
PH7.3±0.1
5.2.12.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至溶解，分装试管，每管1～1.5ml，121℃10min高压灭菌，立即取出冷却备用。

5.2.12.4配制试剂：
甲液：α-萘酚 6.0g
无水乙醇溶液100.0ml
乙液：氢氧化钾40.0g
肌酸0.3g
蒸馏水100.0ml
先将氢氧化钾溶于水中，再加入肌酸。

甲液和乙液保存于4℃冰箱内，可使用2个月。

5.2.12.5试验方法：挑取琼脂培养物接种V-P培养基中，于36±1℃培养24h±2h，将甲液0.2ml（约6滴）加入试管中，摇混均匀，再加入乙酸0.1ml（约3滴），再摇混均匀。

阳性反应立即或15min内呈现红色，阴性反应为铜色。

阴性结果在1h后再做一次检查。

有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。

5.2.12.6注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。

5.2.13 7.5%氯化钠肉汤
5.2.13.1用途：用于金黄色葡萄球菌的增菌培养。

5.2.13.2成份（g/L）：
蛋白胨10.0
牛肉粉 3.0
氯化钠75.0
PH7.4±0.1
5.2.13.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每瓶50ml，121℃15min高压灭菌备用。

5.2.13.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。

5.2.14 Baird-Parker培养基
5.2.14.1用途：用于食品中金黄色葡萄球菌的检验。

5.2.14.2成份（g/L）：
胰蛋白胨10.0 丙酮酸钠10.0
牛肉膏 5.0 甘氨酸12.0
酵母膏 1.0 氯化锂(6H2O) 5.0
琼脂20.0 PH7.4±0.1
5.2.14.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至溶解，分装每瓶95ml，121℃15min 高压灭菌，冷至50℃时，每95ml加入5ml亚碲酸钾卵黄增菌液。

5.2.14.4注意事项：A保存于阴凉干燥处，密封、避光。

B平板冰箱贮存不超过48小时。

5.2.15酸性肉汤
5.2.15.1用途：用于酸性罐头食品商业无菌检验。

5.2.15.2成份（g/L）：
多价蛋白胨 5.0
酵母粉 5.0
葡萄糖 5.0
磷酸氢二钾 4.0
PH5.0±0.2
5.2.15.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃20 min 高压灭菌备用。

5.2.15.4注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。

5.3生化试验培养基和试剂
5.3.1尿素琼脂基础
5.3.1.1用途：用于细菌检验中的尿素酶试验。

5.3.1.2成份（g/L）：
蛋白胨 1.0
葡萄糖 1.0
氯化钠 5.0
磷酸二氢钾 2.0
酚红0.012
琼脂15.0
PH6.8±0.1
5.3.1.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15min高压灭菌，冷至55℃以无菌技术每95ml溶液加入40%尿素水溶液5ml，混匀后制成斜面备用。

5.3.1.4试验方法：挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h，观察结果。

尿素酶阳性者出于产碱而使培养基变为红色。

5.3.1.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。

5.3.2赖氨酸脱羧酶培养基
5.3.2.1用途：用于细菌检验中的赖氨酸脱羧酶试验。

5.3.2.2成份（g/L）：
酵母膏 3.0
葡萄糖 1.0
L-赖氨酸 5.0
溴甲酚紫0.016
PH6.7±0.1
5.3.2.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管1-1.5ml，121℃15min高压灭菌备用。

5.3.2.4试验方法：从琼脂斜面上挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养18-24h，观察结果。

赖氨酸脱羧酶阳性者出于产碱而使培养基变为紫色。

阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变黄色。

对照管应为黄色。

5.3.2.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。

5.3.3吲哚培养基
5.3.3.1用途：用于细菌靛基质试验，亦称色氨酸肉汤。

5.3.3.2成份（g/L）：
蛋白胨10.0
氯化钠 5.0
DL-色氨酸 1.0
PH7.4±0.1
5.3.3.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15min高压灭菌备用。

5.3.3.4配制柯凡克试剂：对二甲氨基苯甲醛10.0g
戊醇150.0ml
浓盐酸50.0ml
将色泽鲜明干燥的对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，缓慢搅拌加入盐酸，加热至
60℃，呈深黄色，静置6-7h，变成黄色即可使用。

试剂宜少量配制，不用时保存于4℃冰箱内。

久存后试液变成褐色不可使用。

5.3.3.5试验方法：挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h，滴加柯凡克试剂0.1ml。

阳性反应出现红色环；阴性反应为黄色环。

5.3.3.6注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。

5.3.4硝酸盐氰化钾培养基
5.3.4.1用途：用于细菌检验中的硝酸盐还原试验和氰化钾试验。

5.3.4.2成份（g/L）：
蛋白胨10.0
氯化钠 5.0
磷酸二氢钾0.225
磷酸氢二钠 5.64
硝酸钾（无亚硝酸盐）1.0
5g/L氰化钾溶液10.0
PH6.8±0.1
5.3.4.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15min高压灭菌，每100ml无菌加入0.5%氰化钾溶液1ml，分装无菌试管备用；同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。

5.3.4.4试验方法：挑取琼脂培养物接种，先接种于吲哚培养基中，混匀，然后灼烧接种环，再沾取吲哚培养基少许接种于氰化钾培养基中，于36±1℃培养24h，观察培养液有无混浊，培养液出现混浊，即有细菌生长，为阳性反应（不抑制）；经2天培养，细菌不生长为阴性反应（抑制）。

5.3.4.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。

5.3.5生理盐水
5.3.5.1用途：用于检样的溶解与稀释。

5.3.5.2成份：（g/L）：
氯化钠8.5g
纯水1000.0ml
5.3.5.3制法：称取氯化钠于纯水中，至完全溶解，分装，121℃高压灭菌15min。