超声场在细胞层次上的生物学效应及其分子机制

超声场在细胞层次上的生物学效应及其分子机制∗
朱杰1, 2，王国栋1
1西北农林科技大学理学院应用物理系杨凌 712100
2陕西师范大学应用声学研究所西安710062
摘要：作为一种强物理因子，超声的生物学作用一直备受关注，随着生物学的发展，人们对超声生物学现象及其机理的理解逐渐深入。

重点综述了超声场在细胞层次的生物学效应，总结了不同参数的超声波在不同介质环境中对细胞的增殖的促进和抑制作用以及对细胞结构与功能的影响，并在分子层面上尝试对超声的生物学效应得机理给予解释。

结合实验结果，对超声生物学效应的可能物理机制进行了初步探讨，并对该课题的研究前景进行了展望。

关键词：超声场；细胞层次；生物学效应；分子机制
中图分类号：R312 文献识别号：A
超声波是频率高于人耳听觉上限阈值的声波，其频谱范围很宽，通常包括2×104Hz至1013Hz及以上。

超声波频率高，波长短，有良好的指向性，衍射现象较少，可在组织界面上反射，也可被细胞反向散射。

此外，超声波可被生物介质所吸收，其吸收程度基本上决定于介质的特性和声波的频率。

一般而言，介质中的含水量越大，吸收越少；而频率越高，吸收则越多。

另外，由于超声波是介质中的一种弹性机械波，可迫使介质粒子形成机械振动，这种含有能量的超声振动引起的与媒质的相互作用，其物理学作用主要包括机械作用、热作用和空化作用；其中，空化是一定强度的超声波在液体中传播时，液体中由于涡流或其它物理作用，致使某些地方形成局部的暂时负压区，从而引起液体或固-液界面断裂，形成微小的空泡或气泡，称为空化泡。

空化泡分为瞬时空化泡和稳定空化泡，空化泡有初生、发育和随后闭合的过程，当其闭合时，会产生微激波，在局部造成高温高压并伴随发光。

上世纪80年代以来，强超声波在生物技术领域中的应用日益受到重视，较高强度的超声波已在破碎细胞，使酶失活和基因转移方面得到了较好应用。

同时，随着研究的深入和发展，学者们对中低强度超声波的生物学效应越来越感兴趣[1-21]，并在研究中发现中低强度超声波作用可以影响细胞的超微精细结构，促进或抑制细胞的增殖，也可促进细胞中酶的生物活性等，这对人们进一步了解超声生物效应及其分子机理和超声在基础医学中的应用十分关键。

1. 超声对细胞增殖的促进与抑制作用
当超声作用于人体组织时，人们总是希望超声能杀伤有害细胞或抑制其增殖，而对于正常细胞则希望尽量少一些副作用。

基于此，人们对不同参数的超声作用及其机理进行了深入的研究。

Ramirez[1]用1MHz，0.4W/cm2的超声处理培养的幼兔跟腱的成纤维细胞，发现胸腺嘧啶整合速度加快及DNA含量明显增加；在细胞增生期，超声能刺激细胞分裂，提示超声能促进结缔组织的愈合。

Doan[2]分别用1MHz脉冲型和45kHz连续型超声作用于体外培养的牙龈成纤维细胞、颚成骨细胞，发现两种超声都诱导了成纤维细胞、成骨细胞增殖，增殖比例达35%～52%，其中频率为45kHz组更明显。

Reher[3]使用传统的1MHz超声和45kHz长波超声处理培养的牙龈成纤维细胞、颚成骨细胞，结果发现成纤维细胞增殖分别增加了47%(0.7mW/cm2)、41%(50mW/cm2)；成骨细胞增殖则分别增加了52%(1.0W/cm2)、
基金项目：教育部科学技术研究重点项目(No.104167)；国家自然科学基金资助项目(No. 20572067)；
作者简介：朱杰(1980- )，男，土家族，湖南张家界人，博士，助教，中国物理学会、中国/美国化学学会、中国/美国细胞生物学会、中国生物物理学会会员，主要从事农业环境生物物理、分子生物物理与理论生物物理研究。

作者通讯：E-mail：jiessy_zhu@。

35%(30mW/cm2)。

Wiltink选用0.1、0.5 W/cm2脉冲型和连续型超声分组处理培养的胎鼠的跖骨残基，实验表明脉冲超声组比连续型超声组的软骨细胞增生更明显。

Parvizi[4]用1.0MHz，50mW/cm2、120mW/cm2脉冲性超声作用于鼠软骨细胞约200ms，以3H-胸腺嘧啶整合方式测定DNA合成，反映细胞增殖状况。

实验表明软骨细胞受到超声作用后也发生了增殖。

Rantanen[5]在用脉冲型超声研究损伤的鼠腓肠肌肌纤维的再生时，发现星形细胞在再生早期用超声刺激后，其增殖高达96%，而且成纤维细胞增殖时间从3～4天延长至7～10天，而对肌肉再生的影响，从形态学上看似乎没有显著效应。

肿瘤是机体在各种致瘤因素的作用下，在基因水平上失去对细胞生长的正常调控，导致异常增生而形成的细胞群。

它是目前危害人类健康最严重的疾病之一。

因而，从细胞水平研究超声对肿瘤的抑制或杀伤作用具有重要意义。

Iro[6]用高能脉冲型超声作用于克隆自人下咽部鳞型细胞癌细胞(FaDu)和成纤维细胞，其中2000次脉冲辐照后残存的FaDu细胞在10天后增殖受到抑制，其受抑制的程度比成纤维细胞更明显。

由此可见，FaDu细胞比成纤维细胞对该类型超声的反应更敏感。

Froytkova[7]使用800kHz连续型超声作用于腹水肿瘤细胞时，显示0.5W/cm2、1.0W/cm2超声能抑制DNA合成，且在5℃时DNA合成抑制最明显；而用0.1W/cm2的超声时，却见到DNA合成的轻度增加。

但在去除超声的作用后,细胞在DNA合成上的变化很快消失。

Nicolai[8]用磁致伸缩式聚焦超声用于膀胱癌细胞系RT112，发现RT112细胞在超声作用后增殖锐减。

Ashush[9]分别用103.7W/cm2、54.6 W/cm2、22.4 W/cm2的三组超声辐照培养的HL-60、Ｋ562、Ｕ937白血病细胞约30s，结果在前两组中探测到空化效应，细胞形态学也发生了改变，包括染色质浓缩、核碎裂、凋亡小体的形成，细胞的增生明显受到抑制。

超声对细胞增殖的影响，主要取决于超声剂量，但由于传插介质、环境温度、辐照距离和换能器面积等超声辐照条件和方式的不同，即使同样剂量超声的生物效应也可能有差异。

一般的实验表明，低剂量超声能促进细胞的增殖，而中、高剂量的超声则可能造成一定的细胞损伤。

而在低声强、长辐照时间范围内，引起损伤的机制是热机制为主；而在高声强、短辐照时间范围内，损伤机制以瞬态空化机制为主。

超声对细胞增殖的影响除了与超声的频率、强度和辐照时间有关外，还与组织细胞的种类和细胞周期有关，增生活跃的肿瘤细胞与正常组织细胞对超声的敏感性是不同的。

2. 超声对细胞结构与功能的影响
膜通透性是细胞膜的重要功能，细胞通过膜通透性摄取细胞外物质，排出细胞内物质，维持其生理功能。

研究发现，使用低强度超声促使细胞膜通透性的增加。

超声致膜通透性改变可使Na+、K+、Ca2+失常地进出细胞，导致细胞的功能发生异常。

Mortimer[10]报告0.5 W/cm2的超声辐照5分钟，可使细胞Ca2+摄入量增加18%。

用1 MHz，300m W/cm2的连续超声可使蛙皮肤离子转运增加，提示超声可使跨膜离子转运加速，即使膜对离子的通透性增加。

超声通过影响细胞膜通透性而影响跨膜离子转运，使细胞内外离子分发生改变，而离子分布改变本身又可影响细胞膜对部分物质的通透性。

超声提高细胞膜通透性也反映在其可促使质粒进人细胞。

Tata等[11]发现超声可使插入GFP基因的质粒转如前列腺癌细胞LnCap，转化率可达65%。

这提示超声对细胞膜通透性的影响可用于使大分子物质进入细胞，这也是其可用于基因转化的基础。

疏水性物质难以进人细胞，超声对膜通透性的影响可用于使这类物质进入细胞。

Rapopori[12]使用超声将脱氧硬脂酸导人绿脓假单胞菌，这提示超声可用于将亲脂性抗生素导人病原体，提高局部浓度而增强其抗菌作用。

Johannes[13]发现超声辐照可使核酸内切酶Alul进入CHO细胞，这提示超声可用于促使酶到达细胞、组织而发挥其作用，这在超声治疗中可予以应用。

在肿瘤生物治疗中，可应用超声的这种作用使生物活性分子更易于到达目标组织，提高疗效和靶向性。

超声生物作用除了导致细胞功能一定程度的改变外，最直接的影响就是造成细胞及其细胞器在形态的变化。

于廷和[14]发现超声辐照可损伤卵巢癌细胞的线粒体，受损细胞线粒体肿胀，体积增大较表面积增大明显，部分细胞线粒体嵴断裂，膜破裂。

Hrazdira[15]超声作用于Hela细胞系认为由于微管蛋白和肌动蛋白的解聚，超声能显著地诱导微管、微丝等细胞骨架成份裂解，但中间丝对该剂量超声的反应较弱。

Yu[14]也发现类似的细胞超微结构改变以及核糖体和染色质均碎裂。

Ashush[9]用750kHz的高强度聚焦脉冲型超声辐照HL-60、U937、M1/2白血病细胞,用3.7W/cm2和54.6W/cm2 在培养基中产生局部空化效应。

细胞的形态学改变还包括染色质凝固、核碎裂、凋亡小体形成。

3. 超声细胞生物学作用的分子机理
随着超声在细胞水平生物效应的深入研究，人们已经逐渐认识到超声对基因的转录、表达、蛋白质的合成、细胞运动与粘附能力等方面的显著影响，并尝试在分子层次上探讨超声生物效应的作用机制。

Parvizi[16]用低强度超声刺激软骨细胞蛋白多糖的合成过程中，发现3到5次超声处理可使mRNA的水平上调；针对α- -蛋白多糖的mRNA表达随时间增加。

Doan[2]发现胶原和非胶原蛋白在受到超声作用后的合成率显著增加，增幅达112%，而以45kHz的超声作用效果最明显。

这些分子水平上的现象可能与低强度超声促进细胞增殖有直接关系。

Alter[17]研究表明，经20kHz、1.5 W/cm2超声辐照15s后，体外培养的平滑肌细胞移动能力下降2～4倍，这种状态将持续24h，而其粘附能力下降5倍。

其粘附和移动能力的下调可能与肌动蛋白纤维解聚，以及粘着蛋白分布下降有关。

Ramirez[1]在胶原酶作用于成纤维细胞时，超声辐照组和对照组胶原合成速度无差别。

加入胶原酶后，合成速度在超声辐照组增加60%，而对照组仅增加20%，这表明在损伤结缔组织基质后，超声能刺激跟腱成纤维细胞合成胶原。

Young[18]用0.5W/cm2、0.75MHz或3.0MHz作用于巨噬细胞样细胞株(U937) 5min后发现0.75MHz的超声似乎通过增加了细胞膜的通透性而使U937释放已经合成的影响成纤维细胞的物质，而 3.0MHz的超声似乎刺激U937合成和分泌促成纤维细胞有丝分裂的因子。

Lejbkowicz[19]报道肿瘤细胞比正常细胞对超声敏感，这可能与肿瘤细胞中DNA 、RNA和蛋白质合成旺盛有关，因为这些大分子的合成为超声作用提供了更多靶点。

Hrazdira[15]研究了子宫上皮肿瘤细胞系(Hela)的超声效应，发现Hela细胞在Ｍ期和Ｓ期对超声较为敏感，这是因为细胞的DNA复制主要在Ｍ期和Ｓ期进行，容易受到超声的影响。

Madiol[20]采用低聚焦超声升温,提高了热休克蛋白mRNA在受辐区的水平。

这提示如以温度敏感的启动子作目的基因的启动子,利用低聚焦超声的热效应可控制目的基因表达，合理的温度控制可调节基因表达的量和持续时间。

提示超声热效应诱导细胞凋亡的机制可能与基因表达的改变有关。

超声空化效应使细胞膜、DNA和其他细胞结构损伤，从而起到抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的作用。

4. 结束语
由于不同类型、不同剂量的超声对不同组织、细胞具有不同的效应，且在同剂量的超声波作用下不同细胞的生物学效应不同，这可能与细胞对超声的敏感性有关。

因此，广泛深入的研究超声的剂量、类型与不同组织、细胞的超声生物学效应以及细胞对超声的敏感性之间的关系，将为超声在医学中的广泛应用提供实验基础。

目前，超声在促进术后伤口愈合，软组织损伤修复、放射性骨坏死及骨折愈合、抑制和杀伤肿瘤等方面的基础研究和临床应用进展较快。

但不能忽视的是，超声作用的副作用，由于超声强度和方向的可控性的技术难题，目前的超声治疗还是较为落后的。

超声抗癌是当前科技界研究的热点，其中声动力学疗法的进展尤其显著。

各国学者对声动力疗法的作用机理开展了多学科的研究工作，作者所在单位在这一领域一直处于国内领先地位，并取得了一定的成果，但对于其确切作用机制目前尚没
有定论；但细胞的凋亡是机体维持自身平衡的一种基本生理机制，恶性肿瘤的发生不仅涉及细胞增殖与分化的异常，还与细胞凋亡机制失常有关，因此，用超声诱导肿瘤细胞发生凋亡或许能为探寻肿瘤的治疗机理提供一种新的思路。

参考文献
1. Ramirez A, Schwane JA, McFarland C, et al The effect of ultrasound on collagen synthesis and fibroblast
proliferation in vitro[J]. Med Sci Sports Exerc，1997，29(3):326-332.
2. Doan N,Reher P，Meghji S ,et al. In vitro effects therapeutic ultrasound on cell proliferation, protein
synthesis，and cytokine production by human fibroblasts，osteoblasts，and monocytes[J] .J Oral Maxillofac Surg,1999，57(4):409-420
3. Reher P, Doan N, Bradnock B, et al. Therapeutic ultrasound for osteo-radio necrosis: an in vitro comparison
between 1MHz and 45kHz machines [J]. Eur J Cancer, 1998, 34(12):1962-1968.
4. ParviziJ,Wu C C, Lewallen D G, et al. Low-intensity ultrasound stimulates proteoglycan synthesis inratchon
drocytes by increasing aggrecan gene expression[J].JOrthopRes,1999,17(4):488-494.
5. Rantanen J, Thorsson O, Wollmer P, et al. Effects of therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal
myofibers after experimental muscle injury [J].Am J Sports Med, 1999, 27(1):54-59.
6. Iro H, V olklein B A, Waldfahrer F, et al. Cytotoxic and anti-prolifer ative effects of high-energy pulsed
ultrasound (HEPUS) on human squamouscell carcinoma cells as compared to connective tissue fibroblasts [J]. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1998, 255(8):420-426.
7. Forytkova L , Hrazdira I，Mornstein V, et al Effect of ultrasound on DNA synthesis in tumorcells
[J].Ultrasound MedBio1,1995,21 (4):585-592
8. Nicolai H, Steinbach P, Knuechel C R, et al. Proliferation of tumor spheroids after shock-wave treatment
[J].JCancerResClinOncol, 1994, 120(7):438-441.
9. Ashush H，Rozenszajn LA, Blass M, et al. Apoptosis induction of human myeloid leukemia cells by
ultrasound exposure[J] Caner Res，2000，60(4) :1014-1020
10. Mortimer A, Dyson M. The effect of therapeutic ultrasound on calcium uptake in fibroblast[J]. Ultrasound
Med Riol 1988, 14: 499-506
11. Tata DB, Dunn F, Tindall DJ. Selective clincal ultrasound signals mediate differential gene transfection and
expresson in two human prostate cancer cell line[J]. Biochem Riophys Commun 1997, 234: 64-67
12. Rapoport N, Smimov A, rimoshin A, et al. Factors affecting the permeability of Pseudomonas aemginosa cell
walls toward lipophilic compounds: effects of ultrasound and cell age[J]. Arch Biochem Biophys 1997, 344: 114-124
13. Johannes C, Obe G. Ultrasound penneabilizes CHO cells for the endonucleaces Alul and bezon nuclease [J].
Mutat Res 1997, 374: 245-257
14. Yu D S, Chen A, Su C J, et al .Effects of high-energy shock waves on murine renalcell carcinoma [J].
Urology, 1991, 38(6):571-576.
15. Hrazdira I，Skorpikove J, Dolnikova M,et al. Ultrasonic ail induced alterations of cultured tumour cells [J].
Eur J Ultrasound, 1998，8(1):43- 49
16. Parvizi J，Parpura V, Greenleaf J F, et al Calcium signaling is required for ultrasound stimulated aggrecan
synthesis by rat chondrocytes[J]J Orthop Res,2002,20(1): 51-57
17. Alter A, Rozenszajn LA, Miller H I, et al. Ultrasound inhibits the adhesion and migration of smooth muscle
cells in vitio[J] . U1trasound Med Bio1,1998,24(5) :711-721
18. Young S R, Dyson M. Macrophage responsiveness to therapeutic ultrasound [J]. Ultrasound Med Biol, 1990,
16(8):809-816.
19. Lejbkowicz F，Salzberg S. Distinct sensitivity of normal and malignant cells to ultrasound in vitro [J].
Environ Health Perspect，1997，105(S16) :1575-1578.
20. Madiol DP，van Gelderen P，Despres D,et al. On the feasibility of MRI- guided focused ultrasound for local
induction of gene expression[J].J Magn Reson I maging，1998， 8(l):101-104
Biological effects of Ultrasound in cell level and its Possible
Mechanisms in molecular level
Zhu Jie1, 2，Wang Guodong1
1 Department of Applied Physics, College of Science, Northwest Agriculture and Forestry
University, Yangling, 712100
2Applied acoustic Institute, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062 P.R China
Abstract
As one important physical factor in biology, the biological effects of ultrasound have attracted plenty of researchers in the entire world. Along with the developments of biology, people could comprehend the ultrasonic effects and its physical mechanisms in biology. This paper has reviewed the biological effects of all kinds of ultrasound in cell level with different parameter under different conditions, and summarized the progress of effects on the cell such as the promotion or inhibition effects to the cellular proliferation, and tries to get the mechanisms of the function and action. According to the experimental data, we prospect the foreground of the researches on the biological effects of ultrasound. Keywords: Ultrasound; Cell; Biologic effect; Physical mechanism。