转座子的插入突变及转座子的应用
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第十九页，课件共有29页
反向PCR法
• 该方法的操作步骤为，提取转座子插 入形成的突变体的染色体，用适宜的 限制性内切酶消化后，用连接酶进行酶 切片段的分子内自连，然后用一对位 于转座子上的外向型引物进行PCR 扩增，
PCR产物直接测序或克隆在T载体上测序， 获取转座子插入位点周围序列的信息。
第二十页，课件共有29页
1、转座后原来 位置上的转 座因子保持 不变；
2、转座过程中 有一共整合体。
Tn 靶
单链交错切割
பைடு நூலகம்
从 3’ 末端复制 产生共合体
共合体 重组
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接
交叉结构(单链转移复合
图 23－41 转座模型。Mu 转座产生交换结构，此结构通过复制产生共合体， 共合体中的转座子之间发生交换产生 2 个重组子。
+
另一条链也被切
受体也被交错切割
图 23-42 交换结构经剪切释放 后导致非复制型转座子插入到靶 DNA 中，DR 包在两侧，供体留 下了一个双链缺口。
供体被释放
Tn 连接到靶上
图 23-43 Tn 的两条链先后被切割，然后转座子与切开 的靶位点连接。
第十页，课件共有29页
（二）复制型 转座
特征：
第三页，课件共有29页
一、转座子的发现
• 转座子是1951年美国玉米遗传育种学家 Mcclintock最早发现的，是针对玉米籽粒中 色斑不稳定现象而提出来的。
• 当时这是一个新概念，它突破了以往人们认 为基因在染色体上的位置是固定不变的认识， 所以一开始并不被大家接受，直到1967年在 大肠杆菌(E．coli)的半乳糖操纵子研究中发 现了这类插入序列，才得以被普遍认同。
第七页，课件共有29页
第八页，课件共有29页
三、转座子的转座机制
据转座子的移动机制，转座可分为： （一）复制型转座
（二）非复制型转座
第九页，课件共有29页
（一）非复 制型转座
特征
1、断裂和重接 反应使靶重 构。
2、供体保持 裂缺。
3、不形成共
整合体。
转座酶结合在 Tn 两端 转座子末端被交错剪切
第十三页，课件共有29页
第十四页，课件共有29页
（4）外显子改组
❖ 当两个转座子被同一转座酶识别而整合到 染色体的邻近位置时，则位于它们之间的 序列有可能被转座酶作用而转座，如果这 个DNA序列中含有外显子，则被切离并可 能插入另一基因组中，这种效应称为外显 子改组（exon shuffling）。外显子改组 将导致基因组中新基因的产生。
2、构建突变体库
转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内 鉴定突变，经转座子诱变的突变子含有已知 的DNA片段，可以通过转座子序列的杂交来 鉴定突变基因的位置，经转座子诱变的突变 体具有高度的极性，使得被诱变的基因以及 同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。
第二十五页，课件共有29页
2、构建突变体库
第二十一页，课件共有29页
六、转座子的应用
❖ 基因的标定
❖构建突变体库 ❖鉴别菌株及群体多样性 ❖生态环境污染的生物修复 ❖转基因生物的克隆
第二十二页，课件共有29页
1、基因的标定
所要分离和克隆的基因不同，在定位和 标定时所用的方法也不同。若要获得感兴趣
的己知目的基因，则采用目的诱变策略，
即用一个稳定遗传的隐性纯合体与一个带有 活跃转座子的显性纯合体杂交，可以在F1代 标定目的基因。
第二十七页，课件共有29页
4、生态环境污染的生物修复
由于基因的可变性及转座子的遗传调控， 许多微生物能够利用人工合成的化学物质， 与微生物分解代谢相关的基因往往与插入
元件相连。当环境污染时，转座子转移频 率提高，增加了微生物种群的生物降解 潜力。
第二十八页，课件共有29页
5、转基因生物的克隆
在细胞工程中，转座子可作为有力的工具和 基因载体系统用于克隆转基因生物。基因组 插入质粒P因子已成功克隆转基因果蝇。通 常认为，转座子的插入能引起新的突变体形 成，但其副作用也许会抵消由转基因提供的 任何优势，以可移动DNA片段作为载体尚存 在转移基因结果的不稳定现象和内源跳跃基 因的相互影响。因此，这方面的应用还处于 探索阶段。
第二十三页，课件共有29页
1、基因的标定
若要获得引起新突变的未知基因，则
用随机诱变策略(非目的诱变)，即将带有功 能性转座因子的显性纯合系植株与不带转 座因子的同种植株杂交，产生的F1子代再 自交，在F2代中就可筛选到转座子随机插 人引起突变表型的突变株，然后选择感兴 趣的新突变株进行研究。
第二十四页，课件共有29页
正因为以上转座子的特征，转座子才被广
泛应用于构建插入突变体库，现已成为 研究基因功能的重要手段之一。目前研 究和应用得较多的有Tn10、Tn5、Tn3 和Mu噬菌体 。
第二十六页，课件共有29页
3、鉴别菌株及群体多样性
转座子通常限制性地分布于特定的真菌 菌株或群体中，可以作为特定菌株的诊 断工具，已用于丝状真菌群体多样性分 析。在医药工业方面已用于有益菌株的 鉴别， 在植物病理学方面已用于鉴别 特定的病原 。
第四页，课件共有29页
一、转座子的发现
• 现在的研究说明，在生物界中转座子 是普
遍存在的，并认为在生物的遗传进化方面
有重要作用。转座子从一个位置转座到另
一个位置的转入和切出过程，改变了原有 基因的结构和排序，从而产生了突变。 • 目前生物体中所发现的10％的突变是由 于它抑制其他基因的表达而形成的。
第十五页，课件共有29页
第十六页，课件共有29页
五、转座子插入位点的鉴定方法
质粒拯救法 反向PCR法
第十七页，课件共有29页
质粒拯救法
该方法的操作步骤为，将转座子插入后形成 的突变体的染色体或质粒DNA用限制性内切酶 消化，凝胶电泳分离后，以转座子上的片段为 探针， 进行 Southern杂交， 确定转座子插入 位点所在片段的大小， 即在电泳分离条带上所 处的位置。
内容提要
一、转座子的发现
二、转座子的分类
三、转座子的转座机制
四、转座子的遗传效应
五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
第二页，课件共有29页
一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易位 子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制 和位移的一段DNA序列。 转座子可以在不同复制子之间转移，以非正 常重组方式从一个位点插入到另外一个位点， 对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效 应。
第二十九页，课件共有29页
然后将这一部分DNA回收， 连接在如 pUC18等克隆载体上，转化大肠杆菌， 并根据 一定的基因标记筛选克隆有转座子插入位点的 片段的菌株。
第十八页，课件共有29页
质粒拯救法
质粒拯救法是转座子应用于分子生物学研究后 应用最广泛的转座子插入位点周围序列鉴定的方 法。但这种方法实验周期比较长， 操作相对繁琐， 为保留选择标记， 有时适宜的限制性内切酶的选 取非常困难。对于一个突变体中有多处转座子插 入的研究以及需要鉴定的突变体数量众多的研究 而言， 这种方法不是一个理想方法。
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四、转座的遗传学效应
❖ （1）插入突变失活或改变基因表达的模式。
插入突变失活是转座的最直接效应，但转座也 可以通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或 改变DNA的结构而影响基因的表达。
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四、转座的遗传学效应
（2）插入位置上出现新的基因。
（3）改变染色体结构。（见下图）
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二、转座子的分类
（一）简单转座子（插入序列，IS） 结构特征： 1、含短的末端反向重复序列（ 15-25bp）; 2、含编码转座酶的基因;
3、靶位点存在 5-9 bp 的短正向重复序列。
第六页，课件共有29页
二、转座子的分类
（二）复合转座子 结构特征： (1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因； (2)两端具有插入序列； (3)两末端是反向重复序列； (4)靶位点存在短正向重复序列。
反向pcr法pcrpcrf1f2转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变经转座子诱变的突变子含有已知的dna片段可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置经转座子诱变的突变体具有高度的极性使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能
转座子的插入突变及转座子的应 用
第一页，课件共有29页
反向PCR法
• 该方法的操作步骤为，提取转座子插 入形成的突变体的染色体，用适宜的 限制性内切酶消化后，用连接酶进行酶 切片段的分子内自连，然后用一对位 于转座子上的外向型引物进行PCR 扩增，
PCR产物直接测序或克隆在T载体上测序， 获取转座子插入位点周围序列的信息。
第二十页，课件共有29页
1、转座后原来 位置上的转 座因子保持 不变；
2、转座过程中 有一共整合体。
Tn 靶
单链交错切割
பைடு நூலகம்
从 3’ 末端复制 产生共合体
共合体 重组
转座子被切开的 末端和靶被切开 的末端连接
交叉结构(单链转移复合
图 23－41 转座模型。Mu 转座产生交换结构，此结构通过复制产生共合体， 共合体中的转座子之间发生交换产生 2 个重组子。
+
另一条链也被切
受体也被交错切割
图 23-42 交换结构经剪切释放 后导致非复制型转座子插入到靶 DNA 中，DR 包在两侧，供体留 下了一个双链缺口。
供体被释放
Tn 连接到靶上
图 23-43 Tn 的两条链先后被切割，然后转座子与切开 的靶位点连接。
第十页，课件共有29页
（二）复制型 转座
特征：
第三页，课件共有29页
一、转座子的发现
• 转座子是1951年美国玉米遗传育种学家 Mcclintock最早发现的，是针对玉米籽粒中 色斑不稳定现象而提出来的。
• 当时这是一个新概念，它突破了以往人们认 为基因在染色体上的位置是固定不变的认识， 所以一开始并不被大家接受，直到1967年在 大肠杆菌(E．coli)的半乳糖操纵子研究中发 现了这类插入序列，才得以被普遍认同。
第七页，课件共有29页
第八页，课件共有29页
三、转座子的转座机制
据转座子的移动机制，转座可分为： （一）复制型转座
（二）非复制型转座
第九页，课件共有29页
（一）非复 制型转座
特征
1、断裂和重接 反应使靶重 构。
2、供体保持 裂缺。
3、不形成共
整合体。
转座酶结合在 Tn 两端 转座子末端被交错剪切
第十三页，课件共有29页
第十四页，课件共有29页
（4）外显子改组
❖ 当两个转座子被同一转座酶识别而整合到 染色体的邻近位置时，则位于它们之间的 序列有可能被转座酶作用而转座，如果这 个DNA序列中含有外显子，则被切离并可 能插入另一基因组中，这种效应称为外显 子改组（exon shuffling）。外显子改组 将导致基因组中新基因的产生。
2、构建突变体库
转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内 鉴定突变，经转座子诱变的突变子含有已知 的DNA片段，可以通过转座子序列的杂交来 鉴定突变基因的位置，经转座子诱变的突变 体具有高度的极性，使得被诱变的基因以及 同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。
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2、构建突变体库
第二十一页，课件共有29页
六、转座子的应用
❖ 基因的标定
❖构建突变体库 ❖鉴别菌株及群体多样性 ❖生态环境污染的生物修复 ❖转基因生物的克隆
第二十二页，课件共有29页
1、基因的标定
所要分离和克隆的基因不同，在定位和 标定时所用的方法也不同。若要获得感兴趣
的己知目的基因，则采用目的诱变策略，
即用一个稳定遗传的隐性纯合体与一个带有 活跃转座子的显性纯合体杂交，可以在F1代 标定目的基因。
第二十七页，课件共有29页
4、生态环境污染的生物修复
由于基因的可变性及转座子的遗传调控， 许多微生物能够利用人工合成的化学物质， 与微生物分解代谢相关的基因往往与插入
元件相连。当环境污染时，转座子转移频 率提高，增加了微生物种群的生物降解 潜力。
第二十八页，课件共有29页
5、转基因生物的克隆
在细胞工程中，转座子可作为有力的工具和 基因载体系统用于克隆转基因生物。基因组 插入质粒P因子已成功克隆转基因果蝇。通 常认为，转座子的插入能引起新的突变体形 成，但其副作用也许会抵消由转基因提供的 任何优势，以可移动DNA片段作为载体尚存 在转移基因结果的不稳定现象和内源跳跃基 因的相互影响。因此，这方面的应用还处于 探索阶段。
第二十三页，课件共有29页
1、基因的标定
若要获得引起新突变的未知基因，则
用随机诱变策略(非目的诱变)，即将带有功 能性转座因子的显性纯合系植株与不带转 座因子的同种植株杂交，产生的F1子代再 自交，在F2代中就可筛选到转座子随机插 人引起突变表型的突变株，然后选择感兴 趣的新突变株进行研究。
第二十四页，课件共有29页
正因为以上转座子的特征，转座子才被广
泛应用于构建插入突变体库，现已成为 研究基因功能的重要手段之一。目前研 究和应用得较多的有Tn10、Tn5、Tn3 和Mu噬菌体 。
第二十六页，课件共有29页
3、鉴别菌株及群体多样性
转座子通常限制性地分布于特定的真菌 菌株或群体中，可以作为特定菌株的诊 断工具，已用于丝状真菌群体多样性分 析。在医药工业方面已用于有益菌株的 鉴别， 在植物病理学方面已用于鉴别 特定的病原 。
第四页，课件共有29页
一、转座子的发现
• 现在的研究说明，在生物界中转座子 是普
遍存在的，并认为在生物的遗传进化方面
有重要作用。转座子从一个位置转座到另
一个位置的转入和切出过程，改变了原有 基因的结构和排序，从而产生了突变。 • 目前生物体中所发现的10％的突变是由 于它抑制其他基因的表达而形成的。
第十五页，课件共有29页
第十六页，课件共有29页
五、转座子插入位点的鉴定方法
质粒拯救法 反向PCR法
第十七页，课件共有29页
质粒拯救法
该方法的操作步骤为，将转座子插入后形成 的突变体的染色体或质粒DNA用限制性内切酶 消化，凝胶电泳分离后，以转座子上的片段为 探针， 进行 Southern杂交， 确定转座子插入 位点所在片段的大小， 即在电泳分离条带上所 处的位置。
内容提要
一、转座子的发现
二、转座子的分类
三、转座子的转座机制
四、转座子的遗传效应
五、转座子插入位点的鉴定方法 六、转座子的应用
第二页，课件共有29页
一、转座子的发现
转座子（transponson,简称Tn）, 又称易位 子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制 和位移的一段DNA序列。 转座子可以在不同复制子之间转移，以非正 常重组方式从一个位点插入到另外一个位点， 对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效 应。
第二十九页，课件共有29页
然后将这一部分DNA回收， 连接在如 pUC18等克隆载体上，转化大肠杆菌， 并根据 一定的基因标记筛选克隆有转座子插入位点的 片段的菌株。
第十八页，课件共有29页
质粒拯救法
质粒拯救法是转座子应用于分子生物学研究后 应用最广泛的转座子插入位点周围序列鉴定的方 法。但这种方法实验周期比较长， 操作相对繁琐， 为保留选择标记， 有时适宜的限制性内切酶的选 取非常困难。对于一个突变体中有多处转座子插 入的研究以及需要鉴定的突变体数量众多的研究 而言， 这种方法不是一个理想方法。
第十一页，课件共有29页
四、转座的遗传学效应
❖ （1）插入突变失活或改变基因表达的模式。
插入突变失活是转座的最直接效应，但转座也 可以通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或 改变DNA的结构而影响基因的表达。
第十二页，课件共有29页
四、转座的遗传学效应
（2）插入位置上出现新的基因。
（3）改变染色体结构。（见下图）
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二、转座子的分类
（一）简单转座子（插入序列，IS） 结构特征： 1、含短的末端反向重复序列（ 15-25bp）; 2、含编码转座酶的基因;
3、靶位点存在 5-9 bp 的短正向重复序列。
第六页，课件共有29页
二、转座子的分类
（二）复合转座子 结构特征： (1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因； (2)两端具有插入序列； (3)两末端是反向重复序列； (4)靶位点存在短正向重复序列。
反向pcr法pcrpcrf1f2转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变经转座子诱变的突变子含有已知的dna片段可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置经转座子诱变的突变体具有高度的极性使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能
转座子的插入突变及转座子的应 用
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