乳酸菌发酵扶正解毒散复合制剂的制备及其在肉鸡上的应用研究

乳酸菌发酵扶正解毒散复合制剂的制备及其在肉鸡上的应用研
究
史洪涛;乔宏兴;王永芬;姜亚乐;边传周
【摘要】本研究旨在制备一种乳酸菌发酵的扶正解毒散复合制剂,并探索其对肉鸡生长性能和免疫器官发育的影响.首先,利用单因子试验法将不同比例的黄芪、板蓝根、淫羊藿及复合中药提取液添加至乳酸菌的培养基中,测定中药对乳酸菌生长的影响;其次,利用正交试验对复合药液培养基进行优化,确定最佳的培养基配方;最后,选取1日龄健康AA肉仔鸡450只,随机分为3组,每组3个重复:对照组(抗生素)、试验Ⅰ组(发酵制剂)、试验Ⅱ组(未发酵制剂),分别在试验的第21、42天测定肉鸡的生长及免疫器官指标.试验结果显示,黄芪、板蓝根、淫羊藿及复合药液组的最高活菌数与对照组相比分别提高了261.64％、505.48％、156.16％、564.38％.通过正交试验得到复合发酵液最适生产培养基配方:复合药液100 mL、红糖2.0g、蛋白胨0.3g、豆粕2.0g,发酵液活菌数为7.13×109 CFU/mL.肉鸡生长试验结果显示,1～42日龄阶段,Ⅰ、Ⅱ组的平均日增重分别比对照组提高了17.84％和8.22％(P＜0.05),料肉比分别比对照组降低了10.88％和4.66％ (P＜0.05),平均日采食量明显高于对照组(P＜0.05);21、42日龄时,Ⅰ、Ⅱ组脾指数分别比对照组提高了11.04％和13.58％ (P＜0.05)、7.79％和7.41％(P＜0.05),法氏囊指数分别比对照组提高了31.30％和26.23％ (P＜0.05)、15.65％和11.48％ (P＜0.05).以上试验结果表明中药提取液能促进乳酸菌的增殖,复合发酵液能够提高肉鸡的生长性能并促进免疫器官的发育.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2016(043)004
【总页数】6页(P1066-1071)
【关键词】乳酸菌;复合中药;发酵;肉鸡
【作者】史洪涛;乔宏兴;王永芬;姜亚乐;边传周
【作者单位】河南牧业经济学院,郑州450046;河南牧业经济学院,郑州450046;河南牧业经济学院,郑州450046;河南农业大学牧医工程学院,郑州450002;河南牧业经济学院,郑州450046
【正文语种】中文
【中图分类】S811.6
乳酸菌是动物生产中常用的一种活菌制剂，具有调节肠道平衡、抑制病原微生物生长繁殖、提高机体免疫力的作用[1-2]。

扶正解毒散是由黄芪、板蓝根和淫羊藿按一定比例组方而成的复合中药，具有清热解毒、扶正祛邪之功效，常用于防制鸡传染性法氏囊病[3]。

传统中药微生态制剂是将中草药和益生菌简单配合而成，虽然在动物生产中起到了一定作用，但是，微生物发酵的潜力并没有得到充分发挥。

微生物可以发酵中草药提取液，具有提高其活性成分含量、提高药效并降低毒副作用的优点[4-5]。

目前，研究集中于益生菌对单味中药及其提取液的发酵，使用乳酸菌发酵组方中药的研究报道较少。

本研究用乳酸菌发酵扶正解毒散提取液，旨在通过培养基的优化制成一种高活菌含量的复合中药微生态制剂并探索其对肉鸡生长性能及免疫器官的影响，为开展中药微生态制剂的研究提供新的思路。

1.1 材料与仪器
乳酸菌菌种由河南牧业经济学院生物工程系生物技术教研室保存；试验用中药购自郑州市国药大药房；MRS培养基购自北京澳博星生物技术有限公司；恒温培养箱购自宁波莱福科技有限公司。

试验用肉鸡由欧普生物科技有限公司提供。

1.2 菌种的活化
将乳酸菌甘油冻存管置于室温，待融化后用无菌接种环挑取少量的菌种用划线法接种于固体MRS培养基上，37 ℃倒置培养24 h，再将其转接至MRS液体培养基，置于恒温培养箱中37 ℃厌氧培养24 h后备用。

1.3 中药提取液的制备
准确称取适量的黄芪，分别加5、3、3倍量的水，煮沸3次，每次约40 min，分别留取每次滤液，最后合并3次滤液并浓缩至原生药含量1 g/mL。

板蓝根与淫羊藿提取液的制法同黄芪，将3种中药提取液按一定比例混合即得复合药液。

1.4 中药提取液添加量及发酵条件
将黄芪、板蓝根、淫羊藿提取液及复合药液按0、1%、3%、6%、12%、24%、50%、100%的添加量加入称量好的MRS液体培养基中，不足部分加蒸馏水补充
至100%，初始pH调至7.0，高压灭菌备用。

发酵参数：培养温度37 ℃，装液
量200 mL，接种量1%，厌氧发酵24 h保存备用。

1.5 复合发酵液生产培养基的正交试验设计
初始生产培养基配方：复合药液100 mL、红糖1.5 g、蛋白胨0.4 g、豆粕1.5 g，三角瓶培养所得发酵液活菌含量约为5.0×109 CFU/mL。

为提高发酵液中活菌含量，以发酵完成后发酵液中乳酸菌数量为指标，选取红糖、蛋白胨、豆粕的添加量进行正交试验，确定3种成分的最适添加比例。

采用L9(34)正交试验表(表1)，接种乳酸菌，发酵时间为24 h。

对试验结果进行极差分析，确定3个因素中影响乳
酸菌数量的关键因素。

1.6 发酵液中活菌数的测定
采用平板菌落计数法进行活菌数测定。

将制备好的发酵液，取1 mL稀释10-7、10-8、10-9倍，取1 mL稀释液置于无菌平板，加入MRS培养基(含琼脂粉)，摇匀，待培养基凝固后，37 ℃倒置培养36 h，查出平板中菌落数，每组设3个重复。

根据公式计算发酵液中活菌总量。

计算公式：
活菌数(个/mL)=平板上菌落数×稀释倍数
1.7 复合发酵液对肉鸡生长性能及免疫器官的影响
1.7.1 试验动物及分组采用单因子试验法，选取450只健康的1日龄AA肉仔鸡，随机分为3组：对照组；试验Ⅰ组为发酵组；试验Ⅱ组为未发酵组，每组3
个重复，每个重复50只仔鸡。

试验期间，对照组使用强力霉素等抗生素，试验Ⅰ、Ⅱ组的制剂按1∶2 000稀释添加至鸡的饮水中。

1.7.2 饲养管理采用网上平养、24 h光照模式，全程自由采食、饮水的饲养方法，试验期为42 d，试验期间观察肉鸡的精神、食欲状况，并做好详细记录。

1.7.3 测定指标与方法
1.7.3.1 生产性能的测定试验第1、21和42天，早晨空腹称重，以计算各阶段的平均日采食量、平均日增重及料重比。

平均日采食量=总采食量/试验天数
平均日增重=(末重-初重)/试验天数
料重比=总采食量/总增重1.7.3.2 免疫器官发育状况的测定在试验的第21、
42天清晨饲喂前，从每个重复中随机选取5只鸡，称重，取脾脏和法氏囊，称鲜重，计算免疫器官指数。

免疫器官指数=免疫器官重量/宰前空腹活重
1.8 统计分析
采用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行显著性分析，结果用平均值来表示，以
P<0.05为差异显著。

2.1 中药提取液对乳酸菌生长的影响
在MRS液体培养基中添加不同比例的中药提取液，以发酵完成后乳酸菌活菌数为指标分析中药提取液对乳酸菌生长的影响，结果见表2。

由表2可知，与对照组相
比，所有试验组每毫升发酵液中乳酸菌活菌数均有不同程度的提高，黄芪、板蓝根、淫羊藿及复合药液的最高活菌数与对照组相比分别提高了261.64%、505.48%、156.16%、564.38%。

黄芪、板蓝根和复合药液，随着提取液添加量的增加，活
菌数逐渐增加，添加量100%时达到最高值，分别为2.64×109、4.42×109、
4.85×109 CFU/mL；淫羊藿组，随着提取液添加量的增加，发酵液中活菌数先升高后降低，添加量6%时达到最高值，为1.87×109 CFU/mL。

3种纯中药组相比，添加量在1%～6%内，以淫羊藿提取液对乳酸菌促生作用最强，黄芪提取液最小；在12%～100%范围内，板蓝根提取液对乳酸菌的促生作用最强，淫羊藿提取液最小。

与纯中药提取液对乳酸菌促生作用相比，添加量在1%～6%范围内，复合药
液仅低于淫羊藿，在12%～100%范围内，复合药液均高于纯中药提取液。

试验结果表明，在提取液添加量较大的情况下(50%、100%)，复合药液对乳酸菌的促生
作用强于单独任何一种纯中药提取液，说明中药提取液在对乳酸菌促生作用方面存在促进作用。

2.2 复合发酵液生产培养基正交试验
为提高发酵液中活菌含量，以发酵完成后，发酵液中乳酸菌数量为指标，选取红糖、蛋白胨、豆粕的添加量进行正交试验，确定3种成分的最适添加比例，正交试验
结果见表3。

由表3可知，在复合药液添加量相同的情况下，9个试验组中第7组的活菌数最高，为7.13×109 CFU/mL，第6组的活菌数最低，为4.19×109 CFU/mL，最高活菌数是最低活菌数的1.7倍，与初始培养基培养乳酸菌所得发酵液相比，活菌数提高了42.60%，其他组的活菌数为4.20×109～6.55×109
CFU/mL，由此确定第7组的营养物质组合为正交试验的最佳组合，即复合药液100 mL、红糖2.0 g、蛋白胨0.3 g、豆粕2.0 g。

由极差R值可知，在3个因素中，豆粕的极差最大，为4.64，说明豆粕的添加量是影响乳酸菌活菌数的主要因素；蛋白胨的极差最小，为1.34，说明蛋白胨对活菌数的影响最小(极差越大说明
对活菌数的影响越大)。

因此，试验的3个因素对乳酸菌活菌数的影响由大到小为：
C>A>B。

2.3 复合发酵液对肉鸡生长性能的影响
通过肉鸡生长试验确定复合发酵液对肉鸡生长性能的影响，结果见表4。

由表4可知，1～21日龄阶段，Ⅰ、Ⅱ组的平均末重分别比对照组提高12.46%和
6.39%(P<0.05)，平均日增重分别比对照组提高13.21%和6.80%(P<0.05)，料重比分别比对照组降低了
7.33%(P<0.05)和2.00% (P>0.05)，平均日采食量均显著高于对照组(P<0.05)。

21～42日龄阶段，Ⅰ、Ⅱ组的平均末重分别比对照组提高了17.50%和
8.05%(P<0.05)，平均日增重分别比对照组提高了20.19%和8.93% (P<0.05)，
料重比分别比对照组降低13.02%和6.05% (P<0.05)，平均日采食量均显著高于
对照组(P<0.05)。

1～42日龄阶段，Ⅰ、Ⅱ组的平均日增重分别比对照组提高了17.84%和
8.22%(P<0.05)，料重比分别比对照组降低了10.88%和4.66%(P<0.05)，平均日采食量均显著高于对照组(P<0.05)。

与Ⅱ组相比，Ⅰ组的平均日采食量、平均日
增重、平均末重均显著提高(P<0.05)，料重比显著降低(P<0.05)。

由以上结果可知，与对照组和未发酵组相比，发酵组肉鸡的生长性能显著提高
(P<0.05)，说明复合药液经发酵后作用效果增强。

2.4 复合发酵液对肉鸡免疫器官发育的影响
通过肉鸡生长试验确定复合发酵液对肉鸡免疫器官发育的影响，结果见表5。

由表5可知，21日龄时，Ⅰ、Ⅱ组肉鸡的脾脏指数分别比对照组提高了11.04%和
7.79%(P<0.05)；42日龄时，Ⅰ、Ⅱ组肉鸡的脾脏指数分别比对照组提高了
13.58%和7.41%(P<0.05)。

21日龄时，Ⅰ、Ⅱ组肉鸡的法氏囊指数分别比对照
组提高了31.30%和15.65%(P<0.05)；42日龄时，Ⅰ、Ⅱ组肉鸡的法氏囊指数分
别比对照组提高了26.23%和11.48%(P<0.05)。

与Ⅱ组相比，Ⅰ组肉鸡的脾脏指数、法氏囊指数均显著提高(P<0.05)。

由以上结果可知，与对照组和未发酵组相比，发酵组肉鸡的脾脏指数和法氏囊指数均显著提高(P<0.05)，说明复合药液经发酵后作用效果增强。

3.1 中药提取液对乳酸菌生长的影响
中药微生态制剂是将微生物发酵技术与中草药生产相结合，用益生菌发酵中草药制成的一种新型的合生元。

中草药中含有丰富的营养成分，如寡糖类、多糖类、氨基酸类和矿物质等，其中许多活性成分可以促进益生菌的生长。

林燕文等[6]研究结
果表明，在泡菜中添加适量的决明子或枸杞子均能促进乳酸菌的生长，且维持高含菌量的时间也较长。

朱新术等[7]研究结果表明，黄芪药液经乳酸菌发酵后，粗多
糖提取率提高111.9%，同时黄芪药液能促进乳酸菌增殖，可使菌体浓度提高251%。

王成涛等[8]报道，添加适量的金银花、青蒿提取液对嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的生长和保存活性有明显的促进作用。

以上研究结果与本试验结果一致，表明某些中草药提取液对乳酸菌的生长具有明显的促进作用。

复合药液活菌数高于纯中药提取液，可能是由于复合药液中的营养成分较全面，乳酸菌促生长因子含量较高及它们之间对乳酸菌促生长具有促进作用等原因所引起的。

3.2 培养基正交试验
本试验采用乳酸菌发酵复合中药提取液，主要是为了在保持培养基中药提取液较高含量的情况下提高乳酸菌的数量。

实验室培养乳酸菌主要使用MRS培养基，但用于工业生产则配制成本较高，不利于推广。

本试验主要采用廉价的农副产品豆粕、红糖，不仅能降低生产成本，而且豆粕中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素及多种微量元素[9]，红糖则富含葡萄糖、果糖及矿物质等，这些成分能为乳酸菌
的正常生长提供丰富的营养，适合发酵企业进行规模化生产。

考虑到试验的简洁性，本试验仅选用了豆粕、红糖这两种廉价的营养成分并进行了初步的探索。

随着研究
的深入，可以选择更多的营养成分如玉米粉、麸皮等添加入培养基中，并对培养基进行优化，使其更加适合乳酸菌的生长。

3.3 复合发酵液对肉鸡生长性能的影响
复合发酵液的主要成分为发酵型扶正解毒散提取液、乳酸菌及其代谢产物等对肉鸡生长有益的营养物质，是提高肉鸡生长性能的主要因素。

扶正解毒散是由黄芪、板蓝根和淫羊藿按一定比例组方而成的复合中药，其组方药物具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力和免疫调节等功能[10-12]。

乳酸菌在肠道生长繁殖的过程中产生多种有益代谢产物，如消化酶、维生素及有机酸等，具有抑制病原菌生长、提高免疫力、促进肉鸡对营养物质的消化吸收等功能[13]。

张凯等[14]研究结果表明，发酵型黄芪提取物可以显著提高肉仔鸡健康状况和生产性能(P<0.05)。

刘观忠等[15]将发酵的复合中药应用于肉鸡，结果表明，与未发酵中药组相比，发酵中药组肉鸡的生产性能显著提高(P<0.05)。

本试验将乳酸菌与中草药提取液通过发酵技术有机结合在一起，制成一种合生元，一方面利用中草药对乳酸菌的促生长作用提高发酵液中乳酸菌的数量；另一方面则通过乳酸菌的发酵来提高中草药的作用效果。

肉鸡生产试验结果表明，与对照组和未发酵组相比，发酵组肉鸡的平均日采食量和日增重均显著提高(P<0.05)，料重比显著降低(P<0.05)。

3.4 复合发酵液对肉鸡免疫器官发育的影响
法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官，是免疫细胞生长、分化的部位；脾脏是重要的外周免疫器官，能产生大量的淋巴细胞，参与全身的细胞免疫和体液免疫。

一般认为，免疫器官重量增加为免疫功能增强的表现，而免疫器官重量降低则为免疫抑制所致[16]。

免疫器官的绝对重量随日龄的增加而增大，但其相对重量呈随日龄增加而减小的趋势。

赵云焕等[17]研究表明，黄芪多糖和益生菌联合应用可显著提高固始鸡雏鸡法氏囊指数和脾脏指数(P<0.05)，且显著提高了仔鸡的生产性能
(P<0.05)。

崔新颖等[18]研究表明，淫羊藿苷能显著提高试验小鼠的脾脏、胸腺质
量，且腹腔巨噬细胞数量及吞噬活性显著提高(P<0.05)。

免疫器官指数的提高可能是由中药中多糖等活性成分及乳酸菌某些代谢产物 (如胞外多糖) 对免疫器官的发育具有促进作用所致。

本研究结果表明，复合发酵液可以显著提高AA肉鸡的法氏囊指数和脾脏指数(P<0.05)，进而提高机体的免疫功能。

本试验结果表明，与对照组相比，纯中药及复合中药提取液均能明显提高发酵液中乳酸菌的活菌数。

通过正交试验得出复合发酵液最适生产培养基配方：复合药液100 mL、红糖2.0 g、蛋白胨0.3 g、豆粕2.0 g，发酵液活菌数为7.13×109 CFU/mL。

肉鸡生产试验结果表明，与对照组和未发酵组相比，发酵组肉鸡的平均日采食量、平均日增重、法氏囊指数和脾脏指数均显著提高，料重比显著降低。