窖池发酵过程中酒醅内酵母菌的分离与分类统计

窖池发酵过程中酒醅内酵母菌的分离与分类统计
论⽂
论⽂题⽬：窖池发酵过程中酒醅内酵母菌的分离与分类统计作者：
单位：
2011年7⽉
摘要:⽩酒的⽣产以泥窖窖池为基础，窖池中的多种微⽣物，特别是栖息于酒醋中的微⽣物左右着酒的产量和品质。

酵母菌同时起着发酵酒精和产⽣⾹味物质的作⽤，是窖池发酵三⼤菌群之⼀，它们在发酵过程中的消长情况值得关注。

本研究分别选取本⼚南车间的⼀⼝窖池以及北车间的两⼝窖池作为分析对象。

分别从原料⼊窖到出窖蒸馏进⾏全程跟踪采样，采样⽅法如下：按发酵0天(⼊窖)、7天、14天、2l 天、28天、49天、70天(出窖)的时间点取样7次；每次共计6个空间区域，即窖池酒醅按纵向分上中下三层，每⼀层分中⼼区域和周边区域，同区域取3点样混合均匀；7次取样共获36个样品(⼊窖和出窖样只有上中下3个样品)。

⾸先，采⽤传统的分离技术对每份样品进⾏平板计数，以便分析在各个窖池发酵过程中不同取样位置酵母菌数量的变化情况；然后采⽤常规的鉴定⽅法对分离到的菌株进⾏鉴定，以探讨发酵过程中存在的优势菌群；最后，采⽤18S rDNA序列分析⽅法，验证常规鉴定结果的准确性，并对各菌属进⾏系统发育分析。

关键词：窖池发酵酵母数量消长优势菌群系统发育浓⾹型⽩酒窖池发酵过程中酵母类微⽣物的分析
绪
长期以来，微⽣物的平板分离计数法(即活菌计数法，CFU法)⼀直是我国科研⼯作者研究窖池微⽣物区系的重要⼿段。

本法将样品⽤⽆菌⽣理盐⽔进⾏系列稀释，取合适的稀释度(⼀般三个稀释度)，以涂布法接种于平板，或以混碟法进⾏操作，经过⼀定时间的培养之后，直接统计平板的菌落。

该⽅法测定的是样品中所含的现时可培养的活的微⽣物数量，所以称之为活菌计数法。

平板分离计数法中，每个菌落由⼀个单细胞繁殖⽽成，为⾁眼可见的细胞群体，⼀般来说在每个平板形成30～300个菌落属于有效范围，该法所测数值有可能偏低，因为有可能两个或以上的单细胞在⼀起形成⼀个菌落，也可能培养条件不适。

平板分离计数法仅能对可培养微⽣物进⾏统计且存在⼀定的偏差，虽然有其⼀定的缺陷性，但它可以得到活的菌落培养物，再通过纯化分离可得到纯种的微⽣物培养物，更全⾯地保留了特定微⽣物的信息，这是当前微⽣物分⼦⽣态学技术所不能做到的。

材料与⽅法
1 实验材料
1.1样品来源
1.1.1分离培养基选择⽤样品
采⾃南车间⼀窖池的出窖糟醅。

1.1.2分析样品
选取本⼚南车间的⼀个窖池，以及北车间的两个窖池分别进⾏跟踪采样，采样⽅法如下：按发酵0天(⼊窖)、7天、14天、21天、28天、49天、70天(出窖)时间点跟踪取样7次；每次共计6个空间区域，即窖池酒醅按纵向分上中下三层(窖顶以下50-
75cm，150-175cm，250-275crn)，按横向分中⼼区域(中⼼区75cm以内)和周边区域(距窖顶各边5．20cm环带)，同区域取3点样进⾏混合平均；7次取样共获36个样品(⼊窖和出窖样只有上中下3个样品)。

1.2培养基
1.2.1酵母分离⽤培养基
1.2.1.1 YPD培养基[4]
葡萄糖 20g
蛋⽩胨 20g
酵母膏 10g
琼脂 20g
蒸馏⽔ 100ml
113℃灭菌30rain
1.2.1.2⽶曲汁培养基[5]
⽶曲汁培养基的制法：
1)将⼲⽶曲磨碎，⼀份⽶曲加四份⽔。

在65℃⽔浴锅中糖化3～4h，糖化程度可⽤碘
滴定之。

2)将糖化液⽤4～6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可⽤及蛋⽩澄清。

⽅法是将⼀个
鸡蛋⽩加⽔约20ml，调匀⾄泡沫时为⽌，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后在过滤。

3)将滤液稀释到5～6波美度，PH约6.4，加⼊2%琼脂。

121℃灭菌20min
1.2.1.3麦⽒琼脂培养基[4]
葡萄糖 1g
KCl 1.8g
酵母浸膏 2.5g
醋酸钠 8.2g
琼脂 20g
蒸馏⽔ 1000ml
113℃灭菌20min
1.2.2酵母鉴定⽤培养基[6]
麦芽汁液体培养基：
将麦芽汁调⾄lO波林的糖度，pH⾄5.4；过滤后分装试管，每管4ml；113℃灭菌20min。

麦芽汁固体培养基：
以10波林麦芽汁，加2%琼脂，加热熔解，分装试管；113℃灭菌20min；摆斜⾯。

McClary培养基：
葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，酵母膏0.25%，醋酸钠O.82%，琼脂2%，⽤蒸馏⽔配：装试管；113℃灭菌15min：搁黄斜⾯。

Kleyn培养基：
KH2P04 0.012%，K2HP04 0.02%，醋酸钠0.5%,葡萄糖0.062%，NaCl
0.062%，蛋⽩胨O.25%，⽔洗琼脂2%，⽣物素2.O微克%，每100ml加混合盐类lml，蒸馏⽔配，pH6.9～7.1；装管；113℃灭菌20min；搁置斜⾯。

混合盐溶液：
MgSO4·7H20 O.4%，NaCl O.4%，CuS04·7H20 0.002%，MnS04·4H20 0.2%，FeS04·4H20 0.2%。

Gorodkowa培养基：
葡萄糖0.1%，蛋⽩胨l%，NaCl 12%，⽔洗琼脂2%，蒸馏⽔配；装管；113℃灭菌20min：搁置斜⾯。

马铃薯块培养基：
将马铃薯去⽪，切成长条斜⾯；装⼊试管(在底部预先垫上⼀⼩团湿棉球)；113℃灭菌30rain。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：
去⽪马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，⾃来⽔1升。

将马铃薯洗净，去⽪，切成⼩块，⽴即放⼊⽔中，以免被氧化。

煮沸30分钟，经纱布过滤，滤液加⽔⾄1升，加⼊葡萄糖和琼脂，溶解后分装三⾓瓶或试管，113℃灭菌20min。

⽟⽶粉琼脂：
称取12.5克黄⽟⽶粉，加⽔300ml搅匀，以60℃⽔浴保温lh，⽤纸过滤，滤液加⽔⾄300ml，加3.89琼脂，121℃15min灭菌，趁热⽤脱脂棉过滤，装⼊试管，每管20 ml，113℃灭菌15min。

糖发酵基础培养基：
1)12.5%⾖芽汁：黄⾖芽125g加⽔1L，煮沸半⼩时，过滤后补⾜⽔⾄lL。

113℃灭菌30min备⽤。

2)0.6%酵母浸汁：加60g⼲酵母粉于lL⽔中，必要时加⼀些蛋清澄清滤液；121℃灭菌15min，趁热⽤双层滤纸过滤；113℃灭菌20min备⽤。

同化碳源基础培养基：
(NH4)2S04 0.5%，KH2P04 0.1%，MgS04·7H20 0.05%，酵母膏 0.02%，CaCl2·2H20 0.01%，NaCl 0.01%，糖或其他碳源O.5%，⽤蒸馏⽔配，培养基过滤后分装⼩试管，每管约3ml，113℃灭菌加20min。

同化⼄醇基础培养基：
(NH4)2S04 0.1%，KH2P04 0.1%，MgS04·7H20 0.05%，酵母膏0.01%，
⽤蒸馏⽔配，过滤后每管定量装5ml，113℃灭菌15min，使⽤时加3%⼄醇。

同化氮源基础培养基：
葡萄糖2%，KH2P04 0.1%，MgS04·7H20 0.05%，酵母膏0.02%，⽔洗琼脂2%，⽤蒸馏⽔配，过滤后装⼤试管，每管约
20ml，113℃灭菌15min。

产类淀粉化合物培养基：
(NH4)2S040.5%，KH2P040.1%，MgS040.05%，酵母膏O.1%，CaCl2·2H20 0.01%，NaCl 0.01%，葡萄糖3%，⽤蒸馏⽔配，分装于50ml三⾓瓶中，约5ml，113℃灭菌20min。

产酯培养基：
葡萄糖5%，⽤10%⾖芽汁配制，分装于50ml三⾓瓶中，每瓶20ml，113℃灭菌20min。

⽆维⽣素基础培养基：
(NH4)2S04 0.5%，KH2P04 0.1%，MgS04·7H20 0.05%， CaCl2·2H20 0.01%，NaCl 0.01%，葡萄糖2%，加蒸馏⽔
100ml，分装试管，每管5ml，113℃灭菌20min。

⽯蕊⽜奶：
取新鲜⽜奶，煮沸15min，冷却后，置冰箱过夜，⽤虹吸管吸取下层液，除去上层脂肪，即成脱脂⽜奶。

每lL脱脂⽜奶加2.5%⽯蕊⽔溶液4ml。

分装试管，113℃灭菌15min。

2 实验⽅法
2.1菌株分离培养基的选择
2.1.1菌株的分离
参照周德庆等[6]，采⽤稀释平板菌落计数法，培养温度为28℃，培养2～3天观察计数。

具体操作如下：
1)取3⽀⽆菌空试管(15×150mm)，依次编号为10-1、10-2、10-3,YPD培养基平板也分别编号为10-1、10-2、10-3,每个稀释度各3只平板；
2)按⽆菌操作，⽤5ml移液管分别吸取4.5ml⽆菌⽔于编好号的各⽆菌空试管中；
3)称取2g酒醅样品，加⼊到装在三⾓瓶中的200ml⽆菌⽔中，充分振荡摇匀：
4)⽤1ml⽆菌移液管精确吸取0.5ml菌液于标为“10-1”试管中，另取⼀⽀1ml的⽆菌
移液管，先在“10-1”菌液管中来回吹吸数次，再精确吸取0.5ml菌液于标为“10-2”试管中，按同样的⽅法吸取0．5ml菌液于杯
为“10-3”试管中；
5)分别精确吸取三个稀释梯度的菌液0.2ml，对号加在YPD培养基平板上，⽴即⽤涂棒迅速将菌液均匀涂开；
6)将涂布后的平板倒置于28℃恒温箱中培养，2～3天后观察计数。

2.1.2分离效果的评价
主要从菌落数量、形态类别、分离效果等指标进⾏判断。

选择分离效果好的作为后续试验的培养基。

2.2发酵过程中菌株数量的分析
2.2.1菌株分离培养及计数
以YPD为酵母分离培养基，28℃培养2～3天，采⽤稀释平板菌落分离计数法进⾏计数嘲。

具体操作⽅法参见2.1.1。

2.2.2整个周期菌株数量的变化
分别对3个窖池，不同取样时间和不同取样位置的酵母菌数进⾏计量，并进⾏相互之间的⽐较。

2.2.3不同窖池中菌株数量的⽐较
按同⼀取样时间，同⼀取样位置，对3个窖池的酵母菌数进⾏横向⽐较。

2.3不同窖池优势菌群的⽐较
2.3.1菌种鉴定
菌落经纯化后，参考中科院微⽣物所《常见与常⽤真菌》、张纪中《微⽣物分类学》、周德庆等《微⽣物学实验⼿册》[6、7、8]等相关的微⽣物分类鉴定系统的⽅法，对分离菌株进⾏以下两⽅⾯的考察：
1)形态特征：细胞形态学观察，固体及液体培养特征，⼦囊孢⼦的形成，假菌丝的形成和形态，以及掷孢⼦的形成和形态；
2)⽣理特性：糖类发酵，碳源同化，氮源同化，产类淀粉化合物的测定，产酯测定，⽜奶胨化或凝固，脂肪分解，在⽆维⽣素培养基中的⽣长实验，37℃下的⽣长温度测试等。

2.3.2优势种群的分析
根据菌种鉴定的结果，对3个窖池中酵母菌优势种群进⾏⽐较。

结果与讨论
1 酵母分离⽤培养基的选择
酵母在YPD培养基、⽶曲汁培养基、麦⽒培养基的分离培养情况见表1-1。

所有的平板采⽤同⼀菌悬液稀释度(10-1)及涂向量(O.2ml)进⾏培养和计数，实验中采⽤的是北车间的出窖酒醅。

由实验结果可以看出，三种培养基在酵母形态及类别上⼏乎⼀致，但从酵母的⽣长菌落数及分离效果⽽⾔，明显以YPD培养基为好，可见采⽤YPD培养基町以对浓⾹型⽩酒糟醅中的酵母菌达到最好的分离培养效果。

由于在对窖池糟醅酵母菌变化的研究中，微⽣物的分离培养⾜基础，因⽽培养基的选择是关键，能较好地满⾜多种类型微⽣物的⽣长和繁殖，才能最⼤限度和⽐较客观地反映糟醅
中微⽣物的种类及其数量，探讨其变化规律。

根据实验结果，我们认为对浓⾹型⽩酒糟醅中酵母的分离培养，以YPD培养基为宜，其配⽅及配制情况如下：葡萄糖20g，蛋⽩胨20g，酵母膏l0g，琼脂20g，蒸馏⽔1000ml，pH⾃然，113℃灭菌
30min。

2 整个发酵周期中酵母菌数的变化
2.1南车间窖池
南车间窖池在发酵过程中各发酵时间点及各空间位置的酵母菌的动态变化结果如表2-l。

从发酵时间来看，酵母菌数量从⼊窖到发酵7天总体上来说是⼀个迅速增加的过程，含最最⾼时每克酒醅样中酵母菌数量为105数量级。

过了7天这个⾼峰后，随时间的推移，菌数基本上是逐渐减少。

发酵三周后，酵母菌数基本趋于稳定，没有⼤的变化，且各个取样点的数量都处在⼀个较低的⽔平上，⼤都只达到102数量级。

结合相关理化的分析结果，发现在发酵⼀周内，由于霉菌对淀粉质原料的糖化作⽤，还原糖含量达到最⼤值，因此酵母菌数量呈⼀个急剧增加的过程。

7天后，酒醅中酒
精浓度迅速增加，21天后达到最⼤值，以后略有下降并逐渐趋于稳定。

发酵温度在14天后达到最⾼点(34℃左右)并维持到28天，说明在7天左右，就基本完成了酵母菌从菌体增殖向酒精发酵的转变，第⼆周⾄第四周是酒精发酵最旺盛时期，28天后趋于减弱。

从各空间位置来看，酵母菌数在同⼀取样层的中间和边沿总体上是⼀致的，最多只有倍数的差距，没有达到数量级的差距。

以不同的取样层相⽐较，除⼊窖样中上层菌数⼤⼤低于中层菌数⽽外，在以后的发酵过程中这两层的菌数基本没有⼤的差异。

⽽下层样的菌数却远远低于上层和中层，⼤都处于102的数量级，且在⼊窖和出窖样中都没检测到。

可能是由于在多轮底发酵⼯艺中，下层多轮不出窖蒸馏，经过多轮发酵的窖底酒醅⼀直未经更换，形成了⼀个极度厌氧和酸性的环境，加上⼀些不利酵母增殖的代谢产物的积累，因此酵母菌数量从⼊窖开始就维持在⼀个很低的⽔平。

2.2北车间窖池1
北车间窖池1在发酵过程中各发酵时间点及各空间位置的酵母菌的动态变化结果如表2-2所⽰。

从发酵时间来看，酵母菌数量从⼊窖到发酵7天总体上来说是⼀个迅速增加的过程，这和南车间有⼀致性。

但是每克酒醅样中酵母菌数量⼤都达到106数量级，最⾼到达107，这是远远超过南车间的。

且在上层样中从第7天到21天，总菌数不降反呈缓慢上升的趋势，在中层样中也是到了14天以后总菌数才开始减少。

从各空间位置来看，同处⼀层的中间和边沿样的酵母菌数总体上没有太⼤差别，这⼀点也同南车间是⼀致的。

以不同的取样层相⽐较，仍然是⼊窖样中上层菌数⼤⼤低于中层菌数，
在以后的发酵过程中，上层菌数却稍多于中层。

⽽下层样的菌数却远远低于上层和中层，⼤部处于102的数量级，有的样品中甚⾄没有检测到。

其原因应该与南车间是⼀致的。

2.3北车间窖池2
北车间窖池2在发酵过程中各发酵时间点及各空间位置的酵母菌的动态变化结果如表2-3所⽰。

从发酵时间来看，从⼊窖到出窖酵母菌数量是⼀个逐渐减少的过程，这和南车间、北车间窖池1呈现的趋势都不相同。

但是每克酒醅样中酵母菌数量较⼤，与北车间窖池1有相似之处，最⾼也到达107数量级，同样远远超过南车间。

从各空间位置来看，同处⼀层的中间和边沿样的酵母菌数总体上仍然没有太⼤差别，这与前两个窖池是⼀致的。

以不同的取样层相⽐较，⼤体呈现上层样总菌数多于中层，中层⼜多于下层的趋势。

但是在⼊窖样中，中层菌数却低于下层菌数，7天以后下层还是能难检测到有酵母的存在。

这也许是本窖池采⽤了与前两个窖池不同的⾮双轮底发酵⼯艺，同时在拌料时⼈为加⼤了酵母接种量，所以才出现下层能检测到⼤量酵母存在以及整个⼊窖样中菌数基本都⽐以后多的现象。

3 发酵过程中优势酵母菌群的变化
3.1南车间窖池中的优势菌群
在南车间窖池中，先后检测到了汉逊酵母(Hansenula)、酒⾹酵母(Brettanomyces)、固囊酵母(Citeromyces)、卵孢酵母(Oosporidium)、德克酵母(Dekkera)和管囊酵母(Pachysolen)。

它们在整个发酵过程的时间上，以及整个窖池空间中的分布情况分述如下。

3.1.1汉逊酵母属（Hansenula）
从表中可以看出，汉逊酵母在⼊窖样的上层和中层都有所检出，且主要集中在⼊窖和发酵14天的样品中。

下层中在任何发酵时间点都没有检测到它的存在。

结果见表3-l所⽰。

3.1.2酒⾹酵母属(Brettanomyces)
在⼊窖的上层和中层中榆测到了酒⾹酵母，⽽且中层的数最多于上层样，这与整个酵母的情况是⼀致的。

在其他的时间点及位置中没育检测到它的存在。

结果见表3-2所⽰。

3.1.3固囊酵母属（Citeromyces)
周囊酵母属在时间和空间上都有较⼴泛的存在。

我们分别在发酵7天、21天、28天和49天的样品中检测到了同囊酵母，并且数量较多，特别⾜第7天，在总菌数种占了⾮常⾼的⽐例。

另外，发酵后期的下层样中也有其存在，表明固囊酵母对下层的恶劣环境有⼀定的耐受性。

结果见表3-3所⽰。

3.1.4卵孢酵母属(Oosporidium)
卵孢酵母主要存在于⼊窖的中层样中，并占有较⼤的⽐例。

另外，在发酵7天的上、中层和发酵28天的上层中也有⼀定数量的存在，下层中也有少量的检出。

结果见表3-4所⽰。

3.1.5德克酵母属(Dekkera)
德克酵母在时间和空间上的分布也⽐较⼴泛。

⼊窖中层样，发酵7天和发酵14天的上中层都有较多量的检出。

发酵后期的上中层以及发酵前期的下层样中也能检测到有少量的存在。

结果见表3-5所⽰。

3.1.6管囊酵母属(Pachysolen)
管囊酵母主要在⼊窖和发酵28天这两个时间点检测到，并且分别存在于中层和上层这两个位置。

出窖的上层样中也有少量存在，在整个发酵周期的下层中部没有检出。

结果见表3-6所⽰。

3.1.7南车间窖池酵母优势菌群概述
从上⾯的结果可以看出，虽然在南车间的窖池中分离到6个属的酵母，但它们不是同时出现，每⼀个属的酵母也不是⾄始⾄终存在于整个发酵周期中。

⼊窖时，上层样中以汉逊酵母为主，另有少量的酒⾹酵母；中层样中存在的属种较丰富，以汉逊酵母、酒⾹酵母、卵孢酵母为主，也有⼀定的管囊酵母和德克酵母。

发酵7天的样中酵母种属的丰度⼤⼤下降，主要以固囊酵母为主，只有少量的德克酵母和卵孢酵母。

发酵14天的样中检测到的酵母较少，只有⼀定的汉逊酵母和德克酵母。

发酵21天的样品种中只检测到了固囊酵母这⼀种优势菌群。

发酵28天的样品中有少量的卵孢酵母、德克酵母和管囊酵母。

发酵49天的样品中分离到少量的固囊酵母和德克酵母。

3.2北车间窖池1
在北车间窖池1中，先后检测到了德巴利酵母(Debaryomyces)、假丝酵母(Candida)、毕⾚酵母(Pichia)和汉逊酵母(Hansenula)。

它们在整个发酵过程时间上的分布，以及在整个窖池空间中的分布情况分述如下。

3.2.1德巴利酵母属(Debaryomyces)
德巴利酵母在北车间窖池1中存在较⼴，在总菌数种占有很⼤的⽐例，并且其消长趋势与总的酵母菌基本⼀致。

但是在发酵7天的样品中却没有检测到，从它的消长情况来看不应该出现这种现象，分析可能是在检测过稃中出现了错误。

结果见表3-7所⽰。

3.2.2假丝酵母属(Candida)
假丝酵母在整个发酵过程在也是⼤量存在。

但是与总菌数之间没有明显契合的滑长⾛势，从⼊窖到发酵7天急剧增值，14天有所下降，⽽在上层中21天⼜达到⼀个商峰。

在发酵后期，假丝酵母在整个窖池都是以⾮常少的数量存在，出窖样中基本检测不到。

结果见表3-8所⽰。

3.2.3毕⾚酵母属(Pichia)
毕⾚酵母主要在发酵的第14天被检测到，且数量较⼤。

特别是在上层边样和中层中样中占有⾮常⾼的⽐例，表明毕⾚酵母在发酵14天左右是北车间窖池1中的优势菌群。

但是从发酵21天及以后的取样中都没有检测到毕⾚酵母。

结果见表3-9所⽰。

3.2.4汉逊酵母属(Hansenula)
汉逊酵母也主要在发酵的第14天检测到，但数量上远不及毕⾚酵母。

另外，发酵28天的样品中也有⼀定的存在，其余时间上基本没有检出。

结果见表3-10所⽰。

3.2.5北车间窖池l酵母优势菌群概述
在北车间窖池l中只分离到4个属的酵母，丰度上略低于南车间窖池和北车间窖池2，但仍然⾜在不同的发酵时期以不同的酵母占主导地位。

⼊窖样特别是中层样中德巴利酵母占据了绝对的优势地位，在上层样中还有⼀部分假丝酵母。

发酵7天的样中基本只分离到⼤量的假丝酵母，其它的酵母都没检测到。

发酵14天的样品中分离到的种群较丰富，以德巴利酵母为主，其它3种酵母的检出也较多。

发酵21天的样品中假丝酵母最多，德巴利酵母次之，其它两种没有检测到。

发酵28天才样品中则是汉逊酵母最多，德巴利酵母次之，并有少量的假丝酵母。

发酵49天的样品中只分离到少量的德巴利酵母和假丝酵母。

3.3北车间窖池2
在北车间窖池2中，先后检测到了德巴利酵母(Debaryomyces)、假丝酵母(Candida)、毕⾚酵母(Pichia)、酵母属酵母(Saccharomyces)、伊萨酵母(1ssatchenkia)和红酵母(Rhodotorula)。

它们在整个发酵过程时间上的分布，以及在整个窖池空间中的分布情况分述如下。

3.3.1德巴利酵母属(Debaryomyces)
与北车间窖池1中的情况相似，德巴利酵母在北车间窖池2中也是⼴泛的存在，在总菌数中占有很⼤的⽐例，其消长趋势也与总的酵母菌消长情况基本⼀致，⽽且在发酵7天的样品中也只检测到少量的存在。

结果见表3-ll所⽰。

3.3.2假丝酵母属(Candida)
北车间窖池2中的假缝酵母也⽐较多，特别在发酵7天和14天的样品中被⼤量的检测到。

其消长情况也与所有酵母总的趋势⼀致，在第7天达到⾼峰后随发酵时间的推移⽽逐渐减少，到发酵后期基本没有被检出。

其结果见表3-12所⽰。

3.3.3毕⾚酵母属(Pichia)
毕⾚酵母主要出现在发酵的第7天和14天样中，并且主要集中在上层样品中，中层和下层只有少量的存在。

从发酵的21天⾄出窖这段发酵期间都没检测到毕⾚酵母的存在。

结果见表3-13所⽰。

3.3.4酵母属(Saccharomyces)
酵母属酵母主要出现在发酵14天和发酵28天的样品中，在⼊窖的上层样和发酵21天的上层样中也有所检出。

发酵49天和出窖的样品中完全没有检测到酵母属酵母的存在。

结果见表3-14所⽰。

3.3.5伊萨酵母属(1ssatchenkia)
与前⼏类酵母相⽐，伊萨酵母的数量较少，主要存在于发酵发酵7天和14天的上层、中层样中。

从发酵21天到出窖部完全没有被检测到，另外下层样中也⾄始⾄终没有被检测到。

结果见表3-15所⽰。

3.3.6红酵母属(Rhodotorula)
红酵母的情况⽐较特别，在其它时间都没有被检测到，却出现在整个发酵过程已完成的出窖中层样品中。

结果见表3-16所⽰。

3.3.7北车间窖池2酵母优势菌群概述
在北车间窖池2中分离到了6个属的酵母，在种属多样性上与南车间窖池相当，⽽且不同的发酵时期仍然以不同的酵母为优势种群。

⼊窖样中，德巴利酵母是绝对优势菌，其它属的酵母都以极其微⼩的⽐例存在，甚⾄不能被检测到。

发酵7天的样品中，假丝酵母取代了德巴利酵母的地位成为新的绝对优势菌，其它属的酵母检出较少。

发酵14天的样品中德巴利酵母的数量⼜急剧增加，在数量上再次占据⾸要地位，其次是假丝酵母，然后是毕⾚酵母和酵母属，伊萨酵母只有极少量存在。

发酵21天的样品中，主要存在的也是德巴利酵母和假丝酵母，其他的数量甚微。

发酵28天的样品中酵母属酵母最多，其次是德巴利酵母。

发酵49天的样品中总菌数已经很少了，还是以德巴利酵母为主。

4 三个窖池的⽐较
由于所处地域的⽓候状况、⼟壤条件、⽔质优劣等环境的不同，以及发酵⼯艺和技术的差异，必然在窖池的发酵过程中出现不同的优势菌群，以及数量上的差异。

也正因为如此，不同的环境和⼯艺技术会⽣产出不同风味和品质的酒来。

窖池所处的环境
⼜有⼤⼩之分，⽐如四川盆地这个降⽔最⼤，平均⽓温较低的亚热带⽣物⽓候区就是孕育了众多⾼品质浓⾹型⽩酒的良好⼤环境；然⽽川酒虽以浓⾹型为主，却各有各的独特风味，除了酿造⼯艺的差异这个原因以外，就要归因于⼩环境的异同了。

因此我们选取了我⼚南、北区域两个车间的窖池进⾏分析，并在同⼀个地⽅选取了两个发酵⼯艺稍有不同的窖池进⾏⽐较。

⾸先从数量上看，北车间两个窖池的酵母菌数远远多于南车间的数量(北车间窖池的总菌数基本上⽐南车间⾼两个数量级)，⽽北车间两个窖池之间在总菌数上却没有较⼤差异。

从消长情况来看，南车间窖池中发酵到7天左右就完成了酵母的增殖过程，总菌数达到了最⾼峰；在北车间窖池1中，发酵到14天和21天左右酵母才增殖完毕；在北车间窖池2中⼀开始就接种了⼤量的菌种，整个发酵过程中酵母菌数从⼊窖到出窖完全是⼀个逐渐减少的过程。

从优势菌群来看，每个窖池都有4～6个属的酵母优势菌群，但是各个窖池中分布的优势菌⼜有所差异。

南车间窖池中以汉逊酵母、酒⾹酵母、固囊酵母、卵孢酵母、德克酵母和管囊酵母为主；北车间窖池1中以德巴利酵母、假丝酵母、毕⾚酵母和汉逊酵母为主，且德巴利酵母和假丝酵母在发酵的某些时段成为唯⼀的绝对优势菌；北车间窖池2中以德巴利酵母、假丝酵母、毕⾚酵母、酵母属酵母、伊萨酵母和红酵母为主，与北车间窖池I相似，德巴利酵母和假丝酵母也在某些时段成为唯⼀的绝对优势菌。

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