腈水合酶及其应用[发明专利]

(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201410758150.9
(22)申请日 2014.12.11
C12N 9/88(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 1/21(2006.01)
C12P 13/02(2006.01)
(71)申请人浙江大学
地址310027 浙江省杭州市西湖区浙大路
38号
(72)发明人杨立荣 郭法谋 王丽燕 吴坚平
徐刚
(74)专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人
胡红娟
(54)发明名称
腈水合酶及其应用
(57)摘要
本发明公开了一种腈水合酶及其应用，该腈
水合酶由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的
氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，β亚基的氨基
酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明从博得特氏菌
DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)中克
隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有
高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性
的腈水合酶。

现有腈水合酶一般对脂肪族腈化合
物有较高活力，对芳香族的腈化合物一般活力很
低。

本发明所述的腈水合酶对芳香族腈化合物，尤
其是2-异丙基对氯苯乙腈，有较高的催化活力。

(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书7页序列表8页 附图4页
(10)申请公布号CN 104498466 A (43)申请公布日2015.04.08
C N 104498466
A
1.一种腈水合酶，由α亚基和β亚基组成，其特征在于，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.一种腈水合酶激活子，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.如权利要求1所述的腈水合酶在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的腈化合物如式(I)或(II)所示：
式(I)中：
或者烷基；
X为OH，H，NH
2
R′为H或具有1-3个C原子的烷基；
取代的具有1-12个C原子的烷基；
R为H或任选地H被NH
2
式(II)中：
R″为单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地H被1个或2个Cl、Br或F取代。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，
式(I)中：
或者具有1-3个C原子烷基；
X为OH，H，NH
2
R′为H或具有1-3个C原子的烷基；
取代的具有1-6个C原子的烷基；
R为H或任选地H被NH
2
式(II)中：
R″为单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地H被1个或2个的Cl、Br或F取代。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的腈化合物为丙烯腈、3-氰基吡啶、2-异丙基对氯苯乙腈和α-甲基苯乙腈中的一种。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的腈化合物为2-异丙基对氯苯乙腈。

腈水合酶及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种腈水合酶及其应用。

背景技术
[0002] 腈是一种重要的化合物，在自然界中广泛存在。

腈水解的方法主要有化学水解法和生物转化法，其中，生物转化法主要涉及腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。

腈水合酶是以硫原子和半胱氨酸亚磺酸残基为绝对中心的一类可催化腈水解的酶，可以催化腈水合生成酰胺，酰胺酶进一步将酰胺催化水解成羧酸化合物，而腈水解酶可以直接催化腈生成羧酸化合物。

通过这些酶的酶促反应可以将腈类物质转化为酰胺、酸、氨基化合物、酯、醇、烯胺等价值更高、应用范围更广的一些化合物。

因此，腈的生物催化水解反应在精细化工产品、医药中间体、手性化合物的合成以及环境治理等方面具有广泛的应用前景。

[0003] 微生物的腈水合酶作为生物催化剂来应用在有机合成工艺上拥有巨大的潜力，有着化学方法无法替代的优越性，如：反应条件温和、环境友好、成本低、具有区域和立体选择性，从而促进了腈水合酶在工业应用中的研制和开发。

产腈水合酶微生物的分布是相当广泛的，如红球菌、假单胞菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等，不同来源的腈水合酶往往有着不同的特性。

其中，一些产腈水合酶的微生物已用于丙烯酰胺、烟酰胺、2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺等的生产中。

如专利号为US007405064B2的专利文献公开了一种睾丸酮丛毛单胞菌5-MGAM-4D；专利号为ZL88106735的专利文献公开了一种玫瑰色红球菌J-1；专利号为ZL86100062的专利文献公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为ZL99106291.4的专利文献公开了一种嗜热假诺卡氏菌JCM3095；专利号为ZL03115536.7的专利文献公开了一种丙酸棒杆菌；专利号为ZL103834600的专利文献公开了一株恶臭假单胞菌，这些野生菌株都用于丙烯酰胺的生产中。

[0004] 丙烯酰胺作为一种重要的基础化工原料，广泛应用于造纸，装璜以及石油开采等方面。

用生物法生产的丙烯酰胺年产量已经达到了60万吨以上。

在我国，用腈水合酶合成丙烯酰胺的生物技术虽然起步较晚，但发展很快，2012年统计数据显示，我国生物法生产的丙烯酰胺占整个丙烯酰胺产量的52％，且逐年增加。

专利号为ZL01822031.2的专利公开了一系列微生物包括芽孢杆菌属、微球菌属、短杆菌属、假单胞菌属、假若卡氏菌属及红球菌属微生物在反应温度为10℃条件下催化生产烟酰胺。

烟酰胺属于B族维生素，在体内以辅酶I及辅酶II的形式参与机体代谢，被广泛应用在医药，食品添加剂及饲料生产上。

专利号为ZL201210239547.8的专利公开了一株野生菌株庆笙红球菌CCTCC No：M2010050用于催化水合制备2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺，其是咪唑啉酮类超高效除草剂的中间体。

[0005] 虽然利用野生菌株工业化生产酰胺类化合物的工艺已得到了广泛的应用，但是，上述工艺普遍存在野生菌株的腈水合酶的酶活稳定性差，对底物和产物的耐受性不高，以及间歇化生产，产品质量不够稳定等问题。

此外，在野生菌株中除腈水合酶外，还存在酰胺酶和腈水解酶，其可以造成副产物羧酸类化合物的积累，从而降低了酰胺类化合物的产率和纯度，同时也增加分离纯化的难度和生产成本。

随着分子生物学的迅猛发展，利用基因重
组技术，构造具有腈水合酶活性的新型基因工程菌株并进行蛋白质工程改造，有望可以在不同程度上解决实际生产问题，比如提高酶的表达水平、增强酶的热稳定性以及对底物和产物的耐受性、阻断副反应的发生；另外，基因工程菌的适应性强、发酵周期短，有利于实现大规模培养和工业化生产，也有助于与后续新工艺配合降低酶的生产和分离成本等。

发明内容
[0006] 本发明提供了一种具有R-异构体立体选择性的、活力高、底物谱广的腈水合酶。

[0007] 一种腈水合酶，由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0008] 编码所述腈水合酶的基因包含碱基序列如SEQ ID NO.1所示的编码α亚基的基因和如SEQ ID NO.2所示的编码β亚基的基因。

该碱基序列来源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)，由1429个碱基组成，自5’端第1位到762位碱基编码腈水合酶α亚基；自5’端第773位到1429位碱基编码腈水合酶β亚基，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

[0009] 所述的腈水合酶的基因还包含编码腈水合酶激活子的碱基序列。

所述的腈水合酶激活子的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，该激活子基因对于腈水合酶基因的高效表达至关重要。

[0010] 为了提高表达活性，所述的腈水合酶基因(SEQ ID NO.3)经修饰后连接有激活子基因(SEQ ID NO.4)，得到如SEQ ID NO.5所示的碱基序列。

[0011] 本发明提供了一种腈水合酶激活子，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0012] 本发明还提供了一种编码所述腈水合酶的基因的表达盒、重组载体和转化子。

[0013] 本发明所述的载体可以是pET-30a(+)，pET-21a(+)，pET-22b(+)，pET-28a(+)，pETDuet-1，pACYCDuet-1，pCDFDuet-1和RSFDuet-1，但不仅限于所述的这些载体。

较佳的是将PCR扩增到的经修饰后的腈水合酶基因连接在表达载体pET-30a(+)上，形成重组表达载体pET-30a(+)-NHaseP。

[0014] 本发明所采用的宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)菌株。

将上述重组表达载体pET-30a(+)-NHaseP转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，其中含有pET-30a(+)-NHaseP重组质粒的菌株，即为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/ pET-30a(+)-NHaseP。

此菌株可在常规的IPTG诱导条件下高效表达腈水合酶蛋白。

该基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的液体培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH为7.0。

培养工程菌的温度为35～40℃，转速为180～220rpm。

[0015] 本发明又提供了一种所述的腈水合酶在催化腈化合物水合反应生成酰胺中的应用。

[0016] 所述的腈化合物如式(I)或(II)所示：
[0017]
[0018] 式(I)中：
[0019] X为OH，H，NH2或者烷基；
[0020] R′为H或具有1-3个C原子的烷基；
[0021] R为H或任选地H被NH2取代的具有1-12个C原子的烷基；
[0022] 式(II)中：
[0023] R″为单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地H被1个或2个Cl、Br或F取代。

[0024] 进一步优选地，式(I)中：
[0025] X为OH，H，NH2或者具有1-3个C原子烷基；
[0026] R′为H或具有1-3个C原子的烷基；
[0027] R为H或任选地H被NH2取代的具有1-6个C原子的烷基；
[0028] 式(II)中：
[0029] R″为单核或双核的不饱和环，其具有6-12个C原子，且其任选地H被1个或2个的Cl、Br或F取代。

[0030] 作为优选，所述的腈化合物为丙烯腈、3-氰基吡啶、2-异丙基对氯苯乙腈和α-甲基苯乙腈中的一种。

更优选，所述的腈化合物为2-异丙基对氯苯乙腈。

[0031] 现有腈水合酶一般对脂肪族腈化合物有较高活力，对芳香族的腈化合物一般活力很低。

本发明所述的腈水合酶对芳香族腈化合物，尤其是2-异丙基对氯苯乙腈，有较高的催化活力。

[0032] 本发明从博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。

附图说明
[0033] 图1为本发明腈水合酶基因和激活子基因的PCR扩增电泳图；
[0034] M：核酸Marker，1～3：腈水合酶基因和激活子基因的PCR扩增产物。

[0035] 图2为本发明重组质粒pET-30a(+)-NHaseP的图谱。

[0036] 图3为本发明基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP诱导表达后的SDS-PAGE电泳图；
[0037] M：低分子量标准蛋白质；
[0038] 1：pET-30a(+)空载质粒对照破胞液；
[0039] 2：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP诱导后菌体破胞液；[0040] 3：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP诱导后菌体破胞上清液；[0041] 4：基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP诱导后菌体破胞沉淀，箭
头分别指示腈水合酶α亚基和β亚基的位置。

[0042] 图4为本发明表达质粒pET-30a(+)-NHaseP的构建示意图。

[0043] 图5为本发明重组腈水合酶催化外消旋2-异丙基对氯苯乙腈的高效液相检测图谱。

具体实施方式
[0044] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并非仅限于此。

[0045] 实施例中的材料与方法为：
[0046] 本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

[0047] 本发明实施例中使用的限制性内切酶EcoRI、HindIII和T4DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-30a(+)、pET-21a(+)，pET-22b(+)等购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。

以上试剂使用方法参考商品说明书。

本发明采用的博得特氏菌DSM 12804(Bordetellapetrii DSM 12804)购自德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)，保藏号为DSM 12804。

[0048] 实施例1
[0049] 一、从博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM 12804)基因组中克隆腈水合酶基因和激活子基因
[0050] 根据博得特氏菌DSM 12804基因组DNA序列(GenBank登录号：AM902716.1)设计引物NP-F(上游引物)和NP-R(下游引物)。

[0051] NP-F序列：5’-CCGGAATTCATGCTCGAAGTTCTTTGCATGG-3’
[0052] NP-R序列：5’-TTCCCAAGCTTGTTAAGCCATTGCGGCAACG-3’
[0053] 在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点EcoRI、HindIII(下划线所示)。

以博得特氏菌DSM 12804基因组DNA为模板，NP-F和NP-R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：
[0054] PCR扩增体系：
[0055]
[0056]
[0057] PCR扩增条件：
[0058] 1)预变性：95℃5min；
[0059] 2)变性：98℃10s；退火：56℃15s；延伸：72℃100s；共循环30次；
[0060] 3)延伸：72℃10min；
[0061] 4)4℃保存2.0h。

[0062] PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小为1800bp左右(如图1所示)。

用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。

[0063] 二、表达载体和工程菌的构建
[0064] 表达载体pET-30a(+)和PCR扩增产物分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切。

酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。

双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-30a(+)上，连接体系如下表1所示：
[0065] 表1pET-30a(+)-NHaseP重组表达质粒连接体系
[0066]
[0067] 将上述连接体系中的各试剂进行混合后，放于16℃金属浴中连接12h。

将酶连产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由测序公司来验证插入序列的正确性。

再将重组表达载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，用PCR法来验证转化的重组子，验证后无误的基因工程菌即为E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP。

[0068] 三、重组腈水合酶的表达及纯化制备
[0069] 将构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP接种至含50μg/ ml Kan的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。

取1.5mL培养液转接至50mL同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD
达到0.8左右时，加入IPTG
600
至其浓度为0.5mM，20℃下诱导20h。

工程菌诱导表达结果的SDS-PAGE电泳图如图3所示。

[0070] 培养结束后，离心收集菌体，弃上清，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。

之后将菌体重悬于Tris-HCl(50mM，pH 7.5，20mM咪唑，0.3M NaCl，5mM二硫苏糖醇)缓冲液中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为含重组腈水合酶的粗酶液。

用0.45μm的滤膜过滤粗酶液，因为重组腈水合酶含有组氨酸标签，随后进行镍离子亲和层析纯化，获得重组腈水合酶的纯酶蛋白。

[0071] 实施例2 基因工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺
[0072] 酶活力单位定义为：在反应条件下，每分钟催化底物反应产生1μmol产物的酶量。

[0073] 取25ml实施例1构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 8.5)的缓冲液重悬收集
的菌体，重悬酶液的酶活力为1700U/ml。

向重悬液中加入1.0ml丙烯腈，20℃下进行水合反应，反应120min。

之后用气相色谱法检测反应体系内的丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸的含量。

底物的转化率大于99％，产率大于92％，在反应体系中没有发现丙烯酸的生成。

[0074] 实施例3 基因工程菌催化3-氰基吡啶生成烟酰胺
[0075] 取25ml实施例1构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 6.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。

向重悬液中加入5.0g 3-氰基吡啶，在37℃下进行水合反应，反应120min。

之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的3-氰基吡啶、烟酰胺的含量。

底物转化率大于99％，产率大于89％。

[0076] 实施例4 基因工程菌催化α-甲基苯乙腈生成α-甲基苯乙酰胺
[0077] 取25ml实施例1构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.5)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。

向重悬液中加入1.0gα-甲基苯乙腈，在25℃下进行水合反应，反应120min。

之后用高效液相色谱法(手性色谱柱)来检测反应体系内的α-甲基苯乙腈、α-甲基苯乙酰胺的含量。

结果发现工程菌在催化外消旋α-甲基苯乙腈时，表现出R-异构体立体选择性，转化率为49％，产率为87％，产物e.e.值为58％。

[0078] 实施例5 基因工程菌催化2-异丙基对氯苯乙腈生成2-异丙基对氯苯乙酰胺[0079] 取25ml实施例1构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP的发酵液，10000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml 50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。

向重悬液中加入0.5g 2-异丙基对氯苯乙腈，在35℃下进行水合反应，反应120min。

之后用高效液相色谱法(手性色谱柱)来检测反应体系内的2-异丙基对氯苯乙腈、2-异丙基对氯苯乙酰胺的含量。

结果发现工程菌在催化外消旋2-异丙基对氯苯乙腈时，表现出R-异构体立体选择性，液相检测结果如图5所示，转化率为49％，产率为90％，产物e.e.值为65％。

[0080] 对比例1
[0081] Fallon，R.d.(Applied Microbiology and Biotechnology，47，156-161，1997)等用恶臭假单胞菌NRRL-18668(Pseudomonasputida NRRL-18668)来催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈的水合反应。

发现该野生菌含有的腈水合酶能催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈水合生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺，并表现出(S)型立体选择性，酶活力为7.1×10-3μmol/min/mg湿细胞。

其最适反应温度为30℃，当温度超过30℃时酶蛋白开始快速失活。

本发明的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-NHaseP催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈时，具有(R)型立体选择性，其酶活力达到25.4×10-3μmol/min/mg湿细胞。

最适反应温度为35℃，在35℃以下酶蛋白表现出相当好的稳定性。

[0082] 对比例2
[0083] Shun-Ichi Masutomo(Bioscience Biotechnology and Biochemistry，59(4)，720-722，1995)等用假单胞菌B21C9(pseudomonas sp.B21C9)来催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈的水合反应。

发现该野生菌含有的腈水合酶能催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈水合生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺，并表现出一定的(S)型立体选择性，但是其活性较低，仅为1.8×10-4μmol/min/mg干细胞。

本发明的工程菌E.coli BL21(DE3)/
pET-30a(+)-NHaseP催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈时，具有(R)型立体选择性，其酶活力达到7.8×10-2μmol/min/mg干细胞。

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[0001] [0002] 序 列 表CN 104498466 A
[0003]
[0004]
[0005]
[0006]
[0007]
[0008]
图1
图2
图3
图4
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21图5说 明 书 附 图CN 104498466 A。