基于心与小肠相表里探讨养心通脉方对冠心病血瘀证大鼠肠道菌群的影响

中文摘要
实验目的
采用高脂饲料喂养和腹腔注射维生素D3、异丙肾上腺素（ISO）的方法制备大鼠冠心病血瘀证模型，基于中医藏象学说“心与小肠相表里”理论，探讨冠心病血瘀证与肠道菌群的关系及养心通脉方对冠心病血瘀证大鼠模型肠道菌群的影响。

实验方法
首先将大鼠随机分为正常组与模型组两组，模型组采用高脂饲养和腹腔注射维生素D3、异丙肾上腺素的方法复制大鼠冠心病血瘀证模型。

造模成功后再将模型组分为4组，分别为冠心病血瘀证组、自然恢复组、阿托伐他汀钙组、养心通脉方组。

养心通脉方干预两周后对大鼠小肠（沿回盲部上循5cm）肠道内容物的大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、真菌进行培养计数，分析冠心病血瘀证与肠道菌群的关系及养心通脉方对肠道菌群的影响。

实验结果
1.大鼠造模后，血脂、血流变各项指标较健康对照组大鼠明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），心电图Ⅱ导联J 点上抬或下移、T波低平或倒置，心脏病理切片结果说明已经成功复制大鼠冠心病血瘀证模型。

2.通过肠道菌群培养分析，发现与健康对照组相比，各组大鼠的大肠杆菌及真菌都有所增加，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

乳酸杆菌及双歧杆菌的数目都明显减少，尤其冠心病血瘀证大鼠更加明显，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

3.养心通脉方干预能够降低TCHO 、TG、 LDL-C指标值，升高HDL-C指标值，与冠心病血瘀证组、自然恢复组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），养心通脉方降低TG指标优于阿托伐他汀钙组（P＜0.05）。

养心通脉方能够降低全血粘度低切、全血粘度高切、红细胞聚集指数、红细胞压积指标值，与冠心病血瘀证组和自然恢复组数值相比，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），养心通脉方组在降低全血粘度低切、全血粘度高切、红细胞聚集指标方面优于阿托伐他汀钙组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

4.养心通脉方干预后，在肠道菌群方面，养心通脉方组与冠心病血瘀证组、
自然恢复组、阿托伐他汀钙组比较，大肠杆菌数目明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与冠心病血瘀证组、自然恢复组比较，养心通脉方组真菌数目均减少（P＜0.05或P＜0.01）；养心通脉方组乳酸杆菌与双歧杆菌的数目较冠心病血瘀证组、自然恢复组、阿托伐他汀钙组相比数量增多，恢复较快，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

实验结论
1. 冠心病血瘀证大鼠肠道存在严重的炎性反应。

冠心病血瘀证大鼠乳酸杆菌及双歧杆菌的数目都明显减少，大肠杆菌及真菌数目明显增多，冠心病血瘀证可能与肠道菌群失衡存在相互影响。

2. 养心通脉方能够有效改善冠心病血瘀证大鼠血脂及血液流变指数；养心通脉方有利于冠心病血瘀证大鼠肠道菌群包括乳酸杆菌、双歧杆菌数量的恢复，有利于改善冠心病血瘀证大鼠模型肠道菌群失衡的病理状态，维持大鼠肠道菌群的多样性，可能为养心通脉方治疗冠心病的作用机制之一。

3. 中药可能通过多靶点、多途径干预调整肠道菌群构成而达到平衡肠道微生态，改善肠道微生态环境，从而达到改善冠心病血瘀证大鼠病理状态，治疗冠心病之目的。

关键词：冠心病；血瘀证；养心通脉方；小肠；肠道菌群
Abstract
Objective
High fat diet and intraperitoneal injection of vitamin D3 and isoproterenol (ISO) were used to prepare the rat model of coronary heart disease with blood stasis syndrome.To explorethe relationship between coronary heart disease with blood stasis syndrome and intestinal microbes and the effect of Yangxin Tongmai decoction on intestinal microbes in rats of coronary heart disease with blood stasis syndrome on the base of“the Heart and the Small Intestine Share a Paired Relationship” of the visceral outward manifestation theory.
Methods
The rats were divided into normal group and model group. The rats in model group were treated with high fat diet and intraperitoneal injection of vitamin D3 and ISO to prepare the rat model of coronary heart disease with blood stasis syndrome. After the model was completed, the model rats were divided into four groups: coronary heart disease with blood stasis syndrome group, natural recovery group, atorvastatin calcium group, and Yangxin Tongmai decoction group. Escherichia coli, bifidobacterium, lactobacillus, and fungi in the intestinal contents of the rat small intestine (5 cm above the ileocecal valve) were cultured after the intervention of Yangxin Tongmai decoction for two weeks. The relationship between blood stasis syndrome and intestinal microflora in rats with coronary heart disease and the effect of Yangxin Tongmai decoction on intestinal microflora were analyzed.
Results
1.After the rat model was completed, the blood lipid, blood rheology and other indicators of model rats were significantly higher than those of the healthy control group, and the difference was statistically significant(p<0.05or p<0.01). The ECG results showed that the J point of lead II were lifted or moved down, and the T wave was low or inverted. The results of pathological examination showed that the rat
model of chronic coronary heart disease with blood stasis syndrome was successfully reproduced.
2.The results of intestinal flora culture showed that ,compared with the healthy control group, the E. coli and fungi of each group were increased, and the difference was statistically significant （p<0.05or p<0.01）.Lactobacillus and Bifidobacterium were significantly reduced, especially in rats with coronary heart disease blood stasis more obvious, the difference was statistically significant（p<0.01）.
3. The application of Yangxin Tongmai Recipe can reduce the indexes of TCHO, TG and LDL-C, and increase the value of HDL-C index, compared with the rats in coronary heart disease, blood stasis syndrome group and natural recovery group. The difference was statistically significant (p<0.05 or p<0.01). The TG index of Yangxin Tongmai group is lowers than atorvastatin calcium group ((p<0.05). The application of Yangxin Tongmai formula can reduce the whole blood viscosity low shear and thewhole blood viscosityhigh shear, erythrocyte aggregation index, hematocrit value index, compared with the blood stasis syndrome of coronary heart disease group and natural recovery group values, the difference was statistically significant (p<0.05 or p<0.01). On the reduction of blood viscosity low shear and blood viscosity high shear, erythrocyte aggregation index, Yangxin Tongmai group was superior to atorvastatin calcium group, and the difference was statistically significant (p<0.05).
4. After the application of Yangxin Tongmai decoction, Yang Xin Tongmai decoction can remarkably reduce the number of E. coli,compared with coronary heart disease, blood stasis group, natural recovery group and atorvastatin calcium group, the difference was statistically significant(p<0.01). Compared with coronary heart disease and blood stasis group, natural recovery group，the number of fungi inrats of Yangxin Tongmai group decreased(p<0.05or p<0.01).The number of Lactobacillus and Bifidobacterium in Yangxin Tongmai formula group increased and recovered quicklycompared with the coronary heart disease blood stasis syndrome group and atorvastatin calcium group. The difference was statistically significant (p<0.05 or p<0.01).
Conclusion
1. There issevere inflammatory responsein rats of coronary heart disease blood stasis syndrome. The number of lactic acid bacteria and bifidobacteria in the blood stasis rats with coronary heart disease decreased obviously, the number of Escherichia coli and fungi increased obviously, and the blood stasis syndrome of coronary heart disease may interact with the imbalance of intestinal flora.
2. Yangxin Tongmai decoction can effectively improve blood lipid and blood flow rheology index in rats with coronary heart disease and blood stasis syndrome.Yangxin Tongmai decoctionis beneficial to the intestinal flora of rats with coronary heart disease blood stasis syndrome, including the recovery of Lactobacillus and bifidobacteria.It is helpful to improve the pathological state of intestinal microflora in rats with chronic coronary heart disease and blood stasis syndrome, and to maintain the diversity of intestinal flora in rats, which may be one of themechanisms of Yangxin Tongmai decoction in treating coronary heart disease.
3.Through the multi-target, multi-channel intervention, Chinese medicine can adjust the composition of intestinal microflora to achieve balanced intestinal microecology, improve intestinal micro-ecological environment, so as to improve the pathological status of coronary heart disease blood stasis rats and treat the coronary heart disease.
Key words: coronary heart disease; blood stasis syndrome; Yang Xin Tongmai decoction; small intestine; intestinal flora
英文缩略词表
英文缩写英文全称中文全称
CHD Coronary Heart Disease 冠心病
CAD Chronic Coronary Heart Disease 慢性冠心病
ACS Acute Coronary Syndrome 急性冠脉综合征
Pectoris 不稳定心绞痛
Angina
UA Unstable
Cholesterol 总胆固醇TCHO Total
TG Triglyceride 甘油三酯
HDL-C High-density Lipoprotein Cholesterol 高密度脂蛋白胆固醇LDL-C Low-density Lipoprotein Cholesterol 低密度脂蛋白胆固醇ISO Isoprenaline 异丙肾上腺素ECG Electrocardiogram 心电图
Oxide 氧化三甲胺TMAO Trimetlylamine
Units 菌落形成单位CFU Colony-Forming
NSTEMI Non-ST-segment elevation Myocardial
非ST段抬高型心肌梗死
Infarction
ST段抬高型心肌梗死STEMI ST-segment elevation Myocardial
Infarction
Grafting 冠状动脉旁路移植术
Bypass
Artery
CABG Coronary
PCI Percutaneous Coronary Intervention 经皮冠状动脉介入治疗
目录
中文摘要 (1)
Abstract (3)
英文缩略词表 (1)
目录 (1)
引言 (1)
第一部分材料与方法 (2)
1.实验材料 (2)
2.实验方法 (4)
第二部分实验结果及分析 (9)
1.冠心病血瘀证大鼠模型的建立 (9)
2. 药物干预后各组大鼠血脂检测 (12)
3. 药物干预后各组大鼠血液流变学检测 (13)
4. 药物干预后各组大鼠肠道乳酸杆菌、双歧杆菌数量 (13)
5. 药物干预后各组大鼠肠道大肠杆菌、真菌数量 (14)
6. 小结 (15)
第三部分理论研究及讨论 (16)
1.中医对胸痹（冠心病）的认识 (16)
2.现代医学对冠心病的认识 (17)
3.养心通脉方治疗冠心病的应用 (17)
4.中医藏象理论“心与小肠相表里”的探讨 (18)
5.现代冠心病与肠道微生态学的关系 (21)
6.养心通脉方对冠心病血瘀证大鼠肠道菌群的影响 (23)
7.中医学与肠道微生态学 (24)
8.前景展望 (25)
结论 (26)
致谢 (27)
参考文献 (28)
附录1 (32)
附件2 (40)
引言
随着我国逐步进入老龄化社会，心脑血管疾病的发病率逐年上升。

据目前流行病学调查，估计每年死于心血管病（包括心脏病和脑血管病）的有约350万人，占总死亡原因的41%，估计每10秒就有1人死于心血管病，其中冠心病已然成为头号杀手[1]。

尽管人们采取了各种现代化治疗方法，如静脉溶栓、心脏介入治疗等，其发病率和死亡率仍居各类致死性疾病前列[2,3,4]。

冠心病动脉粥样硬化的形成机制除了脂质浸润学说、血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说等经典观点以外，多数学者支持“内皮损伤反应学说”，血管内皮细胞损伤是由一系列包括细菌或病毒在内的损伤因子引起，动脉粥样斑块的形成是动脉血管管壁对这些损伤因子的一种保护性、炎症纤维增殖性反应[5]。

近年研究表明，肠道菌群与冠心病发病之间的关系为粥样硬化的形成机制提供了新的观点[6]。

冠心病在中医属于“胸痹”范畴，中医的脏腑经络理论强调各个脏腑的系统功能。

脾胃为后天之本，脾不是单纯的解剖器官，而是“脾系统”。

从脏腑功能的协同性和概括性的角度出发，“脾系统”代表的是消化系统的功能，属于中焦，脾胃与大小肠均归属于“脾系统”，医圣张仲景在《金匮要略》中用理中汤治疗胸痹开辟了从脾胃论治胸痹之先河，另有研究总结[7]近代名医有关胸痹心痛病的医案，其中提到脾胃的频率仅次于心，“心与小肠相表里”与现代学者提出的“肠道菌群失衡可能促发冠心病”的理论具有相吻合之处。

中医药治疗冠心病具有其独特的优势，养心通脉方是经国家首批名老中医药专家学术经验继承人，全国教学名师袁肇凯教授从经典方剂中优选出来治疗胸痹（冠心病）的效验方，并且大量实验及临床研究证实其有较好的治疗冠心病的作用。

本研究以养心通脉方为代表方，建立大鼠冠心病血瘀证模型，探讨该方干预后对大鼠肠道菌群的影响，进一步了解肠道菌群失衡与冠心病发生发展的作用及机制，揭示养心通脉方治疗冠心病的机制是否可能与其调节肠道菌群有关，为从中医藏象理论“心与小肠相表里”出发防治冠心病提供理论依据及临床指导。

第一部分材料与方法
1.实验材料
1.1 实验动物
清洁级SD 雄性健康大鼠80只，体质量(200±10)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物质量合格证号：NO.43004700024153。

动物房温度22℃~26℃，相对湿度40%-70%，自由进食和饮水，适应性饲养1周后用于实
1.2 药品的制备与灌胃剂量
养心通脉方：该方来源于现代名医秦伯未治疗胸痹的有效经验方，后由湖南
成新方养心通脉方[8]。

此方组成为：人参20g、丹参15g、桂枝10 g、枳实10g、
泽泻12g
加10倍量水浸泡0.5 h，然后用电热套加热回流提取1 h，趁热滤过；第2次加8倍量水，同法再煮40 min，混匀两次煎液，浓缩定容至50ml，即得相当于含生药量1.34g/ml，灌胃量等同于成人剂量，养心通脉方灌胃生药量换算为
0.60g/100g。

4℃存放，临用前复温，加热至25-30℃。

阿托伐他汀钙片：（规格：10mg×14片，浙江新东港药业股份有限公司，国药准字：H20133127）。

将阿托伐他汀钙片按每片溶于40ml温开水处理，相当于含生药量0.25mg/ml。

成人剂量为20mg/70K g，大鼠灌胃药量等同于成人剂量，换算为0.18mg/100g。

1.3 主要仪器
仪器名称厂家及型号
血液流变学检测仪赛科希德自动血流变测试仪（SA-6600）电子称上海恒平电子称（JA1203）冷冻离心机德国eppendorf（TGL-18R）
心电图机深圳市凯沃尔电子（ECG-1103LW）
恒温水浴箱河南金博（HH-S2）
普通冰箱广州荣事达（BCD-245）全自动CO2培养箱上海三藤仪器(DH-160I)
超净工作台北京亚泰(YT-CJ-2NB)
光学显微镜上海光学仪器一厂（XTZ-D/E）1.4实验试剂
试剂名称厂家及批号
胆固醇北京索莱宝科技有限公司，批号:20151025
牛胆酸钠北京索莱宝科技有限公司，批号: 20160428
蛋黄粉北京索莱宝科技有限公司，批号: 20160722 维生素D3注射液上通用药业股份有限公司，批号: H31021404
丙硫氧嘧啶片北京索莱宝科技有限公司，批号：20160314 盐酸异丙肾上腺素美国Sigma试剂公司，LOT#：BCBL3044V 水合氯醛天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20120110 1.5培养基
培养基名称厂家及批号
乳酸杆菌选择培养基青岛高科技工业园海博生物技术有限公司
产品批号：HB0392 双歧杆菌琼脂培养基青岛高科技工业园海博生物技术有限公司
产品批号：HB0396-1
SS琼脂（大肠杆菌培养基）杭州滨和微生物试剂有限公司
产品批号：150415 沙保罗氏琼脂（真菌培养基）杭州滨和微生物试剂有限公司
产品批号：150410
2.实验方法
2.1制备冠心病血瘀证大鼠模型
根据参考文献[9]所介绍造模方法及预实验结果，分为两步骤完成：（1）第一步：构建“血瘀证”动物模型。

采取高脂饲养和腹腔注射维生素D3的方法制备模型。

高脂饲料配方为：3%胆固醇、0.5%胆酸钠、15%蛋黄粉、0.2% 丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、66.3%基础饲料，混匀后压制成外形
同基础饲料的高脂饲料（其中白糖与猪油购自附近超市，
[10,11]造模成功率在65%左右，故选取健康
SD 大鼠80只，随机取10只作为健康对照组，普通饲料喂养处理，其余70只作为造模组，进行高脂饲料喂养造模。

造模第1天腹腔注射负荷剂量维生素D3 60万 IU/kg，造模第15天再次腹腔注射维生素D3 20万 IU/kg。

分别于造模第30天、60天对每组大鼠进行眼眶静脉丛采血检测血脂，监测血脂变化；于造模第90天检测血脂与血液流变学相关指标。

将血脂与血液流变指标均发生异常作为“血瘀证”动物模型成功的标志。

（2）第二步：进一步制备冠心病心肌缺血模型。

在第一步造模成功的基础上继续给予高脂饲料喂养，参考文献报道方法[12]及前期研究结果[13]，给予异丙肾上腺素（ISO）腹腔注射（60mg/kg·d），连续注射7天。

造模大鼠均于停药一天后用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3ml/100g），逐一记录Ⅱ导联心电图，以出现J 点上抬或下移、T波低平或倒置作为冠心病血瘀证造模成功的标志，选取心电图变化明显的45只大鼠纳入实验。

其中注射异丙肾上腺素期间大鼠死亡11只。

2.2实验设计及动物分组
实验先随机分为健康对照组10只与模型组70只，动物造模后根据心电图结果将成功造模的45只大鼠随机抽取5只处死后取材做病理切片，余40只再随机分为4组，每组10只。

分别为冠心病血瘀证组、养心通脉方组、阿托伐他汀钙
组、自然恢复组。

合健康对照组共为5组，5组大鼠分别做如下处理：⑴健康对照组继续给予普通饲料喂养；⑵冠心病血瘀证组继续高脂饲料喂养；⑶养心通脉方组，给予养心通脉方灌胃2周，同时停止高脂饲料喂养，换普通饲料喂养；⑷阿托伐他汀钙组，给予阿托伐他汀钙片灌胃2周，同时停止高脂饲料喂养，换普通饲料喂养；⑸自然恢复组，给予等量生理盐水灌胃，同时停止高脂饲料喂养，换普通饲料喂养。

2.3 培养基的选择与配置
2.3.1乳酸杆菌选择培养基
主要成分：胰酪蛋白胨10.0 g/L 酵母浸粉5.0 g/L 磷酸二氢钾6.0 g/L 柠檬酸铵2.0 g/L 乙酸钠25.0 g/L 硫酸镁0.575 g/L 硫酸锰0.12 g/L 亚硫酸铁0.034 g/L 吐温80 g/L 葡萄糖20.0 g/L 琼脂15.0 g/L pH：5.5±0.2 25℃配制方法：称取本品84.7 g，加热溶解于1000 ml蒸馏水中，并吸取1.32 ml 冰乙酸混匀，加热溶解并不停搅拌，倾注无菌平皿。

2.3.2双歧杆菌琼脂培养基
主要成分：蛋白胨15.0 g/L 葡萄糖20.0 g/L 酵母浸粉2.0 g/L 可溶性淀粉0.5 g/L 氯化钠5.0 g/L L-半胱氨酸0.5 g/L 番茄浸粉5.0 g/L 肝浸粉0.3 g/L 琼脂20.0 g/L pH：6.8±0.2 25℃
配制方法：称取本品70.0 g和吐温80 ml，加热混匀溶解于1000 ml蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15-20 min，倾注无菌平皿。

2.3.3 SS琼脂（大肠杆菌培养基）
主要成分：蛋白胨5.0 g/L 牛肉膏5.0 g/L 乳糖10 g/L 琼脂20 g/L 中性红0.025 g/L 硫代硫酸钠8.5 g/L 三号胆盐3.5 g/L 枸橼酸钠8.5 g/L 枸橼酸铁1.0 g/L 煌绿0.00033 g/L pH：7.2±0.4 25℃
配制方法：称取本品62 g，加入蒸馏水1000ml，混匀后加热煮沸溶解，倾注无菌平皿。

2.3.4沙保罗氏琼脂（真菌培养基）
主要成分：蛋白胨10.0 g/L 葡萄糖40.0 g/L 琼脂13 g/L
pH：6.0±0.4 25℃
配制方法：称取本品63 g，加蒸馏水1000毫升，加热溶解分装三角烧瓶，经121℃15分钟灭菌，倾注灭菌平皿。

2.4 大鼠小肠内容物的提取
大鼠灌胃给药14天后，禁食不禁水处理，第15天早上将各组大鼠在相应时间10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 ml/100 g），将大鼠仰卧固定于手术台上，放于超净工作台，严格无菌条件下打开腹腔，找到回盲部，沿肠道回盲部上循5 cm 左右，取回肠约1 cm，称取内容物0.1 g，加9.9 ml生理盐水在无菌匀浆器内匀浆，即以生理盐水10倍稀释作为原液，取原液作1:100，1:1000，1:10000……系列倍比稀释，即得到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8梯度倍比浓度。

菌群培养采用三三制原则，三个稀释度稀释涂板，每个稀释度设置三组平行对照实验，其中细菌取10-6，10-7，10-8浓度，真菌取10-4，10-5，10-6浓度，每个平板加1 ml稀释菌液，约20 ml培养基。

取出0.1 g内容物后立即行腹主动脉采血，普通干管采血2 ml用于检测血脂，肝素钠抗凝采血4 ml用于检测血流变。

2.5 菌群培养条件
大肠杆菌置于37℃有氧条件中培养24小时，计数紫红或粉红菌落；双歧杆菌置于37℃厌氧盒中培养48小时，计数乳白或白色菌落；乳酸杆菌置于5% CO2培养箱37℃培养48小时，计数乳白或白色菌落；真菌置于25℃恒温培养72小时计数乳白或白色菌落。

2.6 菌群计数
菌群每一个稀释度有3个平行对照，求其3个平行的平均值并计算每克肠道内容物所含的菌数。

计算公式：CFU/每克粪便=每一稀释度平均菌落数×稀释倍数/滴种体积 (ml)。

测定肠道大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、真菌等四种主要正常菌群的数量变化。

2.7 样本的提取及实验指标检测
2.7.1血脂检测
分别于造模第30、60、90天对每组大鼠禁食不禁水12小时，进行眼眶静脉丛采血2 ml，于药物干预2周后腹主动脉采血2 ml，采用普通干管采血，静置
30 min
2.7.2血液流变学检测
于造模第90天对每组大鼠禁食不禁水12 h后经髂静脉采血4 ml，于药物干
预2周后腹主动脉采血4 ml，使用肝素钠抗凝管采血，
附属医院中心检验科进行血液流变学检测，利用全自动血流变仪对大鼠全血粘度低切、全血粘度高切、红细胞聚集指数以及红细胞压积进行检测。

2.7.3心电图（ECG）检测
造模组大鼠均于停药一天后用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 ml/100 g），麻醉后仰卧固定，连接心电图机，通过动物心电图机（ ECG-1103LW）逐一记录各组大鼠的Ⅱ导联心电图的心电图信息。

心电信号的采集：心电信号采集使用ECG100C放大器，针式电极3根。

放大器增益设置在2000，高通滤波器设置在0.05 Hz，低通滤波器设置在0.05 Hz OFF。

针式电极连接方法：VIN＋连接左下肢，VIN－连接右上肢，GND连接右下肢。

注意：针式电极应当插入动物的皮下，而不是肌肉中。

所以在插入电极的时候，应当先把要插入部位的皮肤提起，插入电极后再放下皮肤。

2.7.4组织病理HE染色及观察
按照固定、脱水与透明、浸蜡包埋、切片和烤片、脱蜡染色的流程进行组织病理检测。

⑴心脏及小肠标本制备与固定
在造模结束后将模型组随机抽取5只处死后取材，打开胸腔，剪取全部心脏及主动脉弓部位，生理盐水清洗后立即投入4%多聚甲醛液内固定。

打开腹腔找到回盲部，沿回盲部上循5 cm处起截取3 cm左右回肠，清除其内容物时注意避免破坏小肠绒毛，尽量不要剪开组织，生理盐水清洗后置于4%多聚甲醛液中固定。

⑵脱水与透明
将心脏与小肠组织从固定液中取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修整好的组织和对应的标签放于脱水盒内，从低浓度到高浓度酒精（75％、85％、90％、95％浓度）直至无水乙醇用作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。

⑶浸蜡包埋
先将加热融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。

于－20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

⑷切片和烤片
将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，切片4 μm，切片于摊片机40℃左右热水中进行摊片，用载玻片将组织携起并放入45℃恒温箱中烤片。

待干蜡烤化后取出常温保存备用。

⑸脱蜡HE染色
二甲苯脱蜡，经梯度乙醇（100％、95％、85％、75％浓度）水洗，苏木素染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化20 s（提插数下），自来水冲洗返蓝15 min，置0.5％伊红液染色2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干后镜下观察结果并拍照。

2.8 统计学方法
采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计学分析，计量资料采用“⎯x±s”表示，经正态性检验、方差齐性检验，满足方差齐性，两组比较采用t检验，多组比较用方差分析；不满足方差齐性，采用Games Howell（非参多重比较）检验。

以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

第二部分实验结果及分析
1.冠心病血瘀证大鼠模型的建立
1.1大鼠表观特征观察
实验期间每天早上 9:00左右观察实验室温度和湿度、大鼠饮食量、行为、活跃度、毛色状况、精神状态、大便情况（量、次数、颜色等）、死亡情况等，每周记录一次大鼠体重。

健康对照组大鼠反应灵敏，活动自如，饮食饮水均正常，皮毛光亮柔顺；造模30至60天左右，观察到高脂造模组大鼠体重增长逐渐缓慢，并出现精神萎靡倦怠，反应迟钝，活动逐渐减少，喜欢蜷缩成团，相互拥挤，毛色枯槁无华；造模约60至90天左右，模型组体重逐渐下降表现出更明显的蜷缩少动，喜扎堆，饮少食少，背弓毛枯，并出现耳缘、爪甲紫暗，舌质暗红有瘀斑、舌下络脉曲张等表现。

1.2血脂各项指标
分别于造模第30、60、90天及药物干预后对每组大鼠进行眼眶采血以检测其血脂，包括TCHO、TG、HDL-C、LDL-C的含量，结果模型组与正常对照组相比血清中血脂各指标都有升高，并且随着造模时间推移，其升高的趋势更加显著。

其中HDL-C在造模的第30天改变尚不明显，在造模第60天和第90天有明显上升趋势。

结果详见表1、表2。

表1 不同时间点大鼠TCHO、TG变化比较（mmol/L,⎯x±s ）
指标
TCHO
30天60天90天
TG 30天60天90天
对照组
(n=10) 1.44±0.31 1.54±0.03 1.64±0.06 1.26±0.32 1.34±0.04 1.44±0.04
模型组
(n=70) 2.50±0.61* 3.81±0.12** 5.72±0.10** 1.72±0.47* 2.51±0.05** 3.78±0.18**注：与对照组比较，* p<0.05，** p< 0.01。

表2 不同时间点大鼠HDL-C、LDL-C变化比较（mmol/L, ⎯x±s ）
指标
HDL-C
30天60天90天
LDL-C 30天60天90天
对照组
(n=10) 1.17±0.47 1.15±0.07 1.24±0.04 0.23±0.200.24±0.02 0.23±0.17
模型组
(n=70) 1.54±0.68* 1.82±0.06** 2.38±0.06** 1.11±0.12* 2.15±0.04** 3.28±0.51**注：与对照组比较，* p<0.05，** p< 0.01。

1.3血液流变学各项指标
造模第90天检测血流变各项指标，模型组与正常对照组相比全血粘度低切有明显的升高（P＜0.05），全血粘度高切、红细胞聚集指数与红细胞压积均有显著升高（P＜0.01），差异具有统计学意义。

详细指数见表3。

表3 全血血液流变学比较（⎯x±s ）
指标
全血粘度低切
（mpas200/s）全血粘度高切
（mpas200/s）
红细胞聚集指数
（Arbc）
红细胞压积
（L/L）
对照组
(n=10) 18.42±0.53 2.91±0.09 6.19±0.35 0.39±0.02
模型组
(n=70) 21.72±0.74* 5.33±0.41** 10.23±0.52** 0.66±0.04**注：与对照组比较，*p< 0.05，**p< 0.01。

1.4心电图结果
分析各组大鼠记录的Ⅱ导联心电图，由于大鼠心电图ST段变化不易看出，以出现J 点上抬或下移、T波低平或倒置作为冠心病血瘀证造模成功的标志，选取心电图变化明显的 45只大鼠纳入实验。

1.5病理切片结果
⑴两组大鼠冠状动脉及其周边心肌组织病理学检查
两组大鼠冠状动脉及其周围心肌细胞形态学变化：正常组大鼠组可见冠状动脉内皮完整呈波浪状，中膜由2-3层完整的平滑肌细胞组成，外膜由疏松的结缔组织构成，管腔中空无狭窄。

正常组心肌细胞排列整齐，形态完整，无坏死水肿等病理改变。

模型组（冠心病血瘀证）大鼠冠状动脉内膜多处出现增厚突起，向管腔内呈半月形突起，导致冠状动脉管腔明显变狭窄，内膜下组织结构疏松，内膜表面出现纤维组织玻璃样变。

模型组心肌细胞排列紊乱，并且出现炎性浸润、坏死、水肿的病理表现。

结果见图1。

正常组（HE×400）模型组（HE×400）
图1 两组大鼠冠状动脉及其周边心肌组织病理学变化
⑵两组大鼠小肠组织病理学检查
大鼠小肠组织病理形态学变化：正常组大鼠肠绒毛完整, 上皮下间隙无扩张。

模型组大鼠肠绒毛上皮顶端与固有层分离，肠绒毛顶端破裂，炎性浸润、坏死等病理表现。

结果见图2。

正常组（HE×200）模型组（HE×200）
图2 两组大鼠小肠组织病理学变化。