PCR仪的使用方法

PTC-100PCR仪使用指南
1.开机自检：显示“SELF TEST”，约十秒钟结束，此时若仪器不正常，则会出现故障信息，自检正常后，仪器进入初始菜单界面。

Power
键在机身背面右下角处。

2. 运行程序：通过左右select键将焦点调至Run菜单，按Proceed 键，然后再在文件夹中选择所需程序，再按Proceed键，则所选程序开始运行。

3. 菜单简介：共有六种菜单，他们分别执行不同的功能。

1) Run功能：运行程序。

2) Enter功能：编写程序。

Temp：设定温度和时间。

Ramp：调整变温速率。

Goto：设定循环的步骤。

Opinion：附属功能，包括：Extend 循环时时间变化；Increment 循环时温度变化；Beep 循环时声音提示；End：结束程序。

4) List功能：列出程序，查看程序。

5) Edit功能：修改程序。

6) Files菜单功能，包括：Copy：复制程序；Move：移动程序；Rename：修改程序名；Delete：删除程序；Folder：建立文件夹；Secure：加密文件夹。

7) Setup功能设定，包括：lid：热盖温度设定；version：查看软件版本号。

4. 注意事项：在使用PCR仪时，为了实验室一起使用的规范化
1) PCR仪不得用来变性；
2) 每天中午保证PCR仪至少休息一个小时，以延长其使用寿命；
3) 使用前要预约登记；
4) 放入PCR板时，确认PCR板底部干燥，切忌PCR板底部有水时放入PCR仪；
5) 盖子不要拧太紧，尤其是在加热盖的时候，以免损坏盖子；
6) PCR程序运行完之后，请盖上盖子；
7) AFLP，SSR、RAPD等常规程序不得擅自修改、删除、移动，在temple文件夹内可添加个人所需的临时程序。

步骤：
1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”,显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单：
准备执行程序。

2、放入样本管，关紧盖子。

3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：
按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。

4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按《Proceed》，屏幕显示
按《Proceed》，1)选择NEW,命名新的程序，最多8个字母，输入
后按《Proceed》确认(如何输入字母、数字)。

2)输入程序步骤：名字输入后，显示
按《Proceed》则可以输入温度(0～100℃)，按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。

3)选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步(循环数最多可达9999次)(为实际循环数－1)。

4) 选择option,显示
再选择increment,按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值(－0.1℃～6℃)，按《Proceed》确认。

选择extend, 按《Proceed》确认,输入每个循环增加或减少的时间(－60～60秒)，按《Proceed》确认。

选择slop(指温度上升或下降的速率),输入温度的改变值(－0.1～1.5℃)按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。

4)选择End,输入结束步骤.
5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行.
6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。

用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。

编辑程序：
1、可以用《Cancel》键删除输错的值，输入新的值后按《Proceed》确认。

2、对于未输完的程序，要先输入END，按《Proceed》将程序储存后才能删除。

3、删除已经储存的程序：从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM，按《Proceed》，显示主菜单，选择DELET,用《Select》选择删除。

4、查看程序的步骤：在主菜单上选择LIST，按《Proceed》，用《Select》将选择名称，再按《Proceed》，显示程序的第一步，用《Select》键向前、向后翻页查看，此时不能改变程序的值。

编辑已有的程序：
1、从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM，按《Proceed》，显示主菜单，选择EDIT，按《Proceed》确认，用《Select》键选择要编辑的程序，按《Proceed》显示程序的第一步。

2、用《Select》键将光标移到要改变的温度或循环的值上，键入新值，按《Proceed》确认，按《Cancel》删除键入的值，出现空格，键入新值后确认。

注：一旦值被改变或删除，原来的值不能恢复，必须重新键入。

3、编辑时间值：必须重新键入小时、分钟、秒，按《Proceed》。

如何设置一个PCR体系：
一般分为8步：
1、预变性：可用94～95℃，2～10min,一般用5min。

2、变性：一般用94℃，30s~2min,一般45s~1min。

3、退火：温度自定，30s~2min。

4、延伸：70～75℃，一般72℃，对于〈2kb,<1min;>2kb,每增加1kb 加1min。

5、循环数：一般25～35个循环。

6、最终延伸：72℃，5～15min。

7、保存：10℃，时间设为0。

8、END。

PCR仪的使用方法2010-10-09 22:46:59| 分类：分子生物学| 标签：|字号大中小订阅.
（一）试剂PCR仪
（1）引物：决定扩增的特异性。

根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生
物都有自己特异的引物。

（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。

（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl （pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。

10×PCR缓冲液随
酶一起购买。

（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP 钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。

dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。

现用dNTP溶液均有商品化产品。

（5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。

（二）操作程序PCR仪
过去标准的PCR操作程序是将PCR仪必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。

具体如下：
（1）向一微量离心管中依次加入
DNA模板102-105拷贝
引物各1μmol/L
dNTP各200μmol/L
10×PCR缓冲液1/10体积
ddH2O补到终体积（终体积50μl-100μl）
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。

以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。

（2）加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。

置反应管于
97℃变性10min。

（3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。

现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。

（4）PCR仪的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。

最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。

PCR仪尚可用于组织标本DNA的扩增。

由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。

87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。

他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。

但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。

1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。

他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。

将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。

加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。

离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。

在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA 才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。

把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。