NatureMaterials纳米金-CRISPR系统实现造血干细胞中的基因精准编辑

NatureMaterials纳米金-CRISPR系统实现造血干细胞中的
基因精准编辑
造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的研究历史悠久，也是最早用于移植治疗以白血病、地中海贫血为代表的恶性血液疾病的成体干细胞。

虽然HSPCs的异体移植对疾病治疗意义重大，但移植物宿主（GVH）反应依然危害着患者的生命安全；而通过基因治疗改造患者自体的HSPCs或是避免GVH反应是改善患者生存质量的可行策略。

近年来，CRISPR-Cas系统正成为基因编辑和基因治疗的新宠，其中Cas9系统的应用最为广泛，它能在sgRNA的引导下切割靶位点引入平末端的DNA双链断裂（DSBs），之后通过非同源重组修复（NHEJ）途径引入插入缺失突变，或是在DNA模板的存在下经由同源重组修复（HDR）途径实现精准编辑。

在实际操作中，研究者发现，NHEJ介导的插入缺失突变是Cas9基因编辑的主要途径。

与Cas9相比，Cpf1/Cas12a蛋白更小，它在靶位点引入DSBs会产生粘性末端，这一系列特征使得Cpf1或更有助于HDR途径介导的基因编辑事件的发生。

要更好地发挥CRISPR-Cas系统的基因编辑能力，高效的细胞转运/释放工具显得尤为重要。

传统上，HSPCs中应用CRISPR-Cas系统进行基因编辑主要依赖于Cas-sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物的电转染。

然而电转染有不小的细胞毒性，而且很难控制CRISPR-Cas系统不同组分的转染量及比例，这极大限制了基因精准修复的效率。

因此，开发新的Cas-sgRNA RNP复合物的高效转运/释放系统显得尤为重要。

近年来，脂质体纳米颗粒、多聚物纳米颗粒和纳米金颗粒（AuNPs）在转运/释放CRISPR组分至细胞内的研究中取得众多进展【1-3】。

与脂质体及多聚物纳米颗粒相比，AuNPs有诸多优点，一方面AuNPs独特的膜表面特性适合多种不同生物分子的转运，且其表面积已知，可较准确的预测转运效率及组分比例；另一方面，AuNPs 的细胞毒性更低，这有助于提高基因编辑的安全性。

之前有研究者使
用多聚物包裹的AuNPs系统用于CRISPR-Cas9或-Cpf1向肌肉组织和脑组织的转运和释放并取得不错的效果【2,3】。

但这些运载系统中多聚物的使用增加了纳米颗粒的体积，这可能会导致细胞毒性的增加，因此有必要对这类系统加以优化。

2019年5月28日，来自美国西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心的Jennifer E. Adair教授及其团队在Nature Materials上发表题为Targeted homology-directed repair in blood stem and progenitor cells with CRISPR nanoformulations的文章，以AuNP 为载体，通过层层结合不同的CRISPR组分（sgRNA、Cas9或Cpf1核酸酶、单链DNA模板），构建出AuNP/CRISPR运载体，可明显提升HDR效率，实现高效的基因精准编辑。

该研究中，研究者以19nm的AuNP为核心，通过低聚乙二醇和巯基接头结合sgRNA，而后利用Cas核酸酶与sgRNA结合的特性，包裹Cas9核酸酶，由此获得大小为40nm的AuNP/RNP运载体可用于基因编辑。

为实现精准基因编辑，研究者在已获得的AuNP/RNP复合物表面孵以低分子量的PEI以吸附单链DNA模板，最终获得了高效的AuNP/CRISPR精准基因编辑运载体（下图）。

AuNP/CRISPR精准基因编辑运载体示意图。

在HSPCs中，研究者发现，AuNP/CRISPR精准基因编辑运载体可在六小时内成功转染进入细胞。

在Cas9与Cpf1的比较中，研究者发现，Cpf1系统更有助于HDR介导的精准基因编辑的发生，这或许与Cpf1诱导产生的带有粘性末端的DSBs有关；与电转染相比，AuNP/CRISPR精准基因编辑运载体可显著提高HDR效率并改善细胞存活状况；而克隆形成实验和小鼠骨髓移植实验发现，AuNP/CRISPR 处理对HSPCs的适应性并无明显副作用，且增强了HSPCs在小鼠骨髓中的重建潜能。

总结而言，AuNP/CRISPR精准基因编辑运载体在减少毒副作用、提升HDR介导的精准基因编辑效率和改善HSPCs的移植效果方面均有良好的效果，这对改系统的未来应用有重要意义。

AuNP为基础的高效运载体还可进一步用于其它类型的基因编辑平台如单碱基编辑平台，并用于其它的细胞类型中，这将拓展其在医学研究和临床治疗中的应用价值。

原文链接：
/10.1038/s41563-019-0385-5
制版人：珂
参考文献
1. Finn, J.D., et al., A Single Administration of CRISPR/Cas9 Lipid Nanoparticles Achieves Robust and Persistent In Vivo Genome Editing. Cell Rep, 2018. 22(9): p. 2227-2235.
2. Lee, K., et al., Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair. Nat Biomed Eng, 2017. 1: p. 889-901.
3. Lee, B., et al., Nanoparticle delivery of CRISPR into the brain rescues a mouse model of fragile X syndrome from exaggerated repetitive behaviours.Nature Biomedical Engineering, 2018. 2(7): p. 497-507.。