聚乙二醇修饰蛇毒凝血酶样酶[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 1912115A
[43]公开日2007年2月14日
[21]申请号200510041407.X [22]申请日2005.08.11
[21]申请号200510041407.X
[71]申请人上海医药工业研究院
地址200437上海市北京西路1320号
共同申请人江苏正大天晴药业股份有限公司
[72]发明人冯军 武霞 赵文杰 高勇 张来芳 张喜
全 张锡昌 [51]Int.CI.C12N 9/74 (2006.01)A61K 38/48 (2006.01)A61P 7/02 (2006.01)
A61P 25/00 (2006.01)
权利要求书 3 页 说明书 19 页
[54]发明名称
聚乙二醇修饰蛇毒凝血酶样酶
[57]摘要
本发明公开一类聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样
酶，其结构式为mPEG－O－(CH 2)n －T－NH－R，基
团定义见说明书，本发明的聚乙二醇修饰的蛇毒凝
血酶样酶可以作为抗凝溶栓药物或神经保护药物。

本发明得到的N末端氨基聚乙二醇修饰蛇毒凝血酶
样酶不但比未修饰的酶有较低的免疫原性，而且与
聚乙二醇修饰降纤酶相比较，其酶活性保留和降纤
能力得到了提高，稳定性增加。

本发明的制备方法
简单易行。

200510041407.X权 利 要 求 书第1/3页
1、一种聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，结构通式如下：
mPEG-Y-NH-R
其中m为单甲氧基的缩写；
Y为聚乙二醇或其衍生物在修饰后留下的残基；
R为去除一个N末端氨基的蛇毒凝血酶样酶分子。

2、如权利要求1所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，结构通式如下： mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R
其中m为单甲氧基的缩写，n＝0~3；
T为：或为：CH2；
R为去除一个N末端氨基的蛇毒凝血酶样酶分子。

3、如权利要求1所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，为如下结构
其中m为单甲氧基的缩写，n＝0~3；
R为去除一个N末端氨基的蛇毒凝血酶样酶分子。

4、如权利要求1、2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中R为去除一个N末端氨基的从蛇毒中提取或用基因工程手段制备的重组蛇毒凝血酶样酶分子。

5、如权利要求4所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中R为去除一个N末端氨基的提取的蛇毒凝血酶样酶分子。

6、如权利要求5所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中R为去除一个N末端氨基的降纤酶分子、安可洛酶分子、巴曲酶分子、蕲蛇酶分子。

7、如权利要求6所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中R为去除一个N末端
氨基的降纤酶分子。

8、如权利要求2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中n为2。

9、如权利要求1、2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中聚乙二醇链的分子量为2000-200000。

10、如权利要求1、2或3所述的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶，其中聚乙二醇链的分子量为5000-30000。

11、权利要求1的聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶的制备方法，包括在蛇毒凝血酶样酶溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应温度为4-40℃，反应时间为5~120分钟，反应中活化的聚乙二醇或其衍生物与蛇毒凝血酶样酶的摩尔比为0.1~100，将反应混合液采用离子交换层析技术和凝胶过滤层析技术进行色谱分离，即可得聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶。

12、如权利要求11所述的制备方法，其中反应温度为25℃。

13、如权利要求11所述的制备方法，其中调节p H值在6.5。

14、如权利要求11所述的制备方法，其中反应中蛇毒凝血酶样酶与活化的聚乙二醇或其衍生物的摩尔比为1∶10。

15、如权利要求11、12、13或14所述的制备方法，其中离子交换层析采用阴离子交换层析，流动相为含NaCl的磷酸盐缓冲液。

16、如权利要求11、12、13或14所述的制备方法，其中凝胶过滤层析使用Superdex75pre grade作为层析介质。

17、如权利要求11、12、13或14所述的制备方法，其中活化的聚乙二醇或其衍生物，为丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛。

18、权利要求1化合物在制备去纤、抗凝、溶栓、降脂、扩张血管和改善微循环药方面的应用。

19、如权利要求18所述的应用为在制备抗凝溶栓药物或神经保护药物方面的应用。

200510041407.X说 明 书第1/19页
聚乙二醇修饰蛇毒凝血酶样酶
技术领域
本发明涉及一类蛇毒凝血酶样酶，具体地说是一类聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶。

背景技术
蛇毒凝血酶样酶(thrombin-like enzyme，TLE)是指从蛇毒中提取的一类蛋白酶，它类同生理凝血酶能降解血浆纤维蛋白原，因此也被称为类凝血酶。

迄今已发现30余种蛇毒中含有凝血酶样酶组份，并有20余种先后得到分离和纯化，其中部分已作为治疗药物而广泛应用于临床(贺海平，梁宁生.蛇毒类凝血酶的研究概况.蛇志，2000；12：73-77.)。

其中在国内外应用最广泛的凝血酶样酶有来自于马来西亚红口蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)蛇毒的安可洛酶(Ancrod)，来自于巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒的巴曲酶(Batroxobin)，来自于江浙尖吻蝮蛇(A g k i s t r o d o n a c u t u s)和长白山白眉蝮蛇(A g k i s t r o d o n h a l y s brevicaudus stejneger)蛇毒的降纤酶，以及来自于江浙尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒的蕲蛇酶。

国内外多年的临床实践证明这些来自于蛇毒的凝血酶样酶在去纤、抗凝、溶栓、降脂、扩张血管和改善微循环等方面作用明显，疗效确切，但是在使用过程中也发现这些药物同样具有蛋白质药物所共有的特点，如具有免疫原性，半衰期短，稳定性差等。

几十年来已有多例蛇毒凝血酶样酶的临床不良反应报告，其中最常见的不良反应是过敏反应。

临床上迫切需要具有低免疫原性的蛇毒凝血酶样酶，从而改善该类药物的药效，降低毒性。

目前，在对蛋白质药物进行化学修饰的研究领域中，应用最多，成功率最高的是聚乙二醇(P E G)修饰技术。

在蛋白质药物的P E G修饰研究中大多数是将多肽分子中赖氨酸的ε氨基或N末端氨基作为修饰位点，其它的P E G修饰基团包
括半胱氨酸的巯基、游离羧酸基团(例如，C末端氨基酸残基的游离羧酸基团，天冬氨酸或谷氨酸残基的游离羧酸基团)、丝氨酸及苏氨酸的羟基。

蛋白质药物经聚乙二醇化修饰后具有降低免疫原性、增加水溶性、显著延长其在生物体内的半衰期等优点，但也可能因修饰而影响其与受体的结合，因此寻找合适的修饰位点，保持持续、有效的生物活性是多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰研究的主要目的，也是研究中的难点所在。

目前大多数的观点认为，N末端氨基修饰的产物可以最大程度的保留原蛋白质药物的活性。

专利申请C N1563367公开了聚乙二醇修饰降纤酶，在该申请中仅公开了聚乙二醇对降纤酶的修饰，没有公开对其它几种蛇毒凝血酶样酶如安可洛酶、巴曲酶和蕲蛇酶的聚乙二醇修饰，同时也没有进一步公开修饰产物的具体修饰位点，只是公布了对降纤酶分子的单修饰，这种单修饰可以是降纤酶分子的N末端氨基，也可能是其中一个赖氨酸残基的氨基，作为药物进行开发它具有样品的均一性低，质量控制较难的缺陷。

发明内容
本发明的目的是公开一类聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶及其制备方法，具体地讲是仅N末端氨基聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶，以满足蛇毒凝血酶样酶在临床应用方面的需求。

所说的聚乙二醇修饰技术是本领域一般技术人员所公知的，并且描述于例如Robert MJ等，先进药物输送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)(2002；54：459-476)。

我们采用各种带酰胺基或亚酰胺基的聚乙二醇衍生物、各种带醛基的聚乙二醇衍生物对蛇毒类凝血酶中的氨基进行修饰；采用P E G-马来酰亚胺(PEG-maleimide)、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺(PEG-iodoacetamide)、PEG-邻-吡啶-二硫醚(PEG-ortho-pyridyl-disulphide)对蛇毒类凝血酶中半胱氨酸的巯基
进行修饰；采用各种带酯或酰氨基的聚乙二醇衍生物对蛇毒类凝血酶中的羧基进行修饰；采用PEG-酰肼(PEG-hydrazide)对蛇毒类凝血酶中丝氨酸或苏氨酸的羟基进行修饰。

令人惊喜的是，采用离子交换层析技术和凝胶过滤层析技术进行色谱分离，我们得到了仅N末端氨基聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶。

并且动物实验的结果显示仅N末端氨基修饰的产物最大程度的保留了原蛋白质药物的活性。

本发明的具体的技术方案如下：
一类聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶，其结构通式为：
mPEG-Y-NH-R
其中m为单甲氧基(monomethoxy)的缩写；
Y代表聚乙二醇或其衍生物在修饰后留下的残基，是mPEG-Y D与蛇毒凝血酶反应后除聚乙二醇长链外的残基，其中m P E G-Y D为活化的聚乙二醇或其衍生物，可以是：单甲氧基聚乙二醇、单甲氧基聚乙二醇羧酸衍生物、单甲氧基聚乙二醇酯类衍生物、单甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇对硝基苯碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇碳酰咪唑、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛和单甲氧基聚乙二醇乙醛通过酸水解形成的乙缩醛水合物等等。

R为去除一个N末端氨基(NH2)的蛇毒凝血酶样酶分子。

优选的结构为：
mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R
其中m为单甲氧基的缩写，n＝0～3；
T为：或CH2；
R为去除一个N末端氨基(NH2)的蛇毒凝血酶样酶分子。

当T为：时为一种修饰产物，具体为：
当T为CH2时为另一种修饰产物，具体为：
mPEG-O-(CH2)n-CH2-NH-R；
具体地分别为：
I：mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R1
其中：m为单甲氧基的缩写，n＝0～3；
T为：或CH2；
R1代表去除一个N末端氨基的降纤酶分子。

II：mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R2
其中：m为单甲氧基的缩写，n＝0～3；
T为：或CH2；
R2代表去除一个N末端氨基的安可洛酶分子。

III：mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R3
其中：m为单甲氧基的缩写，n＝0～3；
T为：或CH2；
R3代表去除一个N末端氨基的巴曲酶分子。

IV：mPEG-O-(CH2)n-T-NH-R4
其中：m为单甲氧基的缩写，n＝0～3；
T为：或CH2；
R4代表去除一个N末端氨基的蕲蛇酶分子。

本发明的特点是在蛇毒凝血酶样酶的N末端氨基上连接聚乙二醇链，该聚乙二醇链可以是直链的也可以是带支链的。

所说的聚乙二醇链的分子量为2000～200000。

优选的聚乙二醇链的分子量为5000-30000。

所说的蛇毒凝血酶样酶包括从蛇毒中提取或用基因工程手段制备的重组蛇毒凝血酶样酶；具体地指降纤酶、安可洛酶、巴曲酶和蕲蛇酶这四种蛇毒凝血酶样酶，但并不仅限于这四种蛇毒凝血酶样酶。

本发明的聚乙二醇修饰蛇毒凝血酶样酶的制备方法包括如下步骤： 在蛇毒凝血酶样酶溶液中，加入磷酸氢二钠溶液，调节其pH值在4.5-9.5，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，反应温度为4-40℃，反应时间为5～120分钟，反应中活化的聚乙二醇或其衍生物与蛇毒凝血酶样酶的摩尔比为0.1～100，将反应混合液采用离子交换层析技术和凝胶过滤层析技术进行色谱分离。

离子交换层析采用阴离子交换层析，流动相为含N a C l的磷酸盐缓冲液，即可得聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶。

制备反应按下式进行：
mPEG-Y D为活化的聚乙二醇或其衍生物，可以是：单甲氧基聚乙二醇、单甲氧
基聚乙二醇羧酸衍生物、单甲氧基聚乙二醇酯类衍生物、单甲氧基聚乙二醇二氯三嗪衍生物、单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇对硝基苯碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇三氯苯碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇碳酰咪唑、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇羧酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛单甲氧基聚乙二醇乙醛通过酸水解形成的乙缩醛水合物等等。

其中R-NH2为蛇毒凝血酶样酶。

Y为聚乙二醇或其衍生物在修饰后留下的残基；
更具体的
其中R-N H2为蛇毒凝血酶样酶。

m P E G为：C H3O-(C H2C H2O)n’-C H2C H2 其中：m＝单甲氧基的缩写，n’＝44～2200，n＝0～3；
D为：
R代表去除一个氨基(NH2)的蛇毒凝血酶样酶分子。

所说的活化的聚乙二醇或其衍生物是本领域一般技术人员所公知的，如甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛、单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙
二醇丁醛。

优选地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，也可使用单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛，这些修饰剂可采用美国Nektar Therapeutics公司生产的产品。

离子交换层析采用阴离子交换层析进行分离，所使用的阴离子交换层析介质为本领域所公知的层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如Q Sepharose系列、DEAE Sepharose 系列、DEAE Sephacel系列、QAE Sephadex系列、DEAE Sephadex系列、SOURCE Q系列等，其中最优的使用S O U R C E 30Q作为层析介质进行分离，阴离子层析的柱体积为6～600ml，流速为0.5～50ml/min；用起始缓冲液平衡3～8倍柱体积；上样量为2～200ml；先用1～5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+N a C l缓冲液(B)，优选为起始缓冲液+1.0m o l/L N a C l缓冲液，B从0～100％，洗脱20倍C V。

起始缓冲液可使用乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液、巴比妥-盐酸缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液等，这些缓冲液的pH可从3.0～10.0，其中最优地使用pH为6～9的Tris-HCl 缓冲液。

收集各洗脱组份，用S D S-P A G E和反相高效液相色谱(R P-H P L C)进行分析，合并聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶，待进行下一步的凝胶过滤层析。

用截留分子量1000～10000D a的醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，所使用的凝胶过滤介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如S e p h a r o s e系列、Sephacel系列Sephadex系列和Superdex系列等，其中最优的使用Superdex75pre grade作为层析介质进行分离，凝胶过滤层析柱体积为25～2500ml；流速为0.1～
10ml/min；PBS缓冲液平衡1～2倍柱体积；上样量为0.2～20ml；PBS缓冲液洗脱1～2倍柱体积。

收集各洗脱组份，用S D S-P A G E和R P-H P L C进行分析，合并单聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶。

本发明聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶具有去纤、抗凝、溶栓、降脂、扩张血管和改善微循环的药理作用，可以用于制备高效低毒的抗凝溶栓药物，神经保护药物。

本发明聚乙二醇化蛇毒凝血酶样酶能够基本保持蛇毒凝血酶样酶的生物活性，同时它比未修饰的蛇毒凝血酶样酶有较低的免疫原性和更好的稳定性，因此作为药物它比未修饰的蛇毒凝血酶样酶有更大的优越性。

特别是本发明得到的N末端氨基聚乙二醇修饰蛇毒凝血酶样酶同文献专利申请C N1563367公开的聚乙二醇修饰降纤酶相比较，其酶活性保留和降纤能力得到了提高，稳定性增加。

本发明的聚乙二醇修饰的蛇毒凝血酶样酶的制备方法，简单易行。

具体实施方式
实施例1
丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(m P E G-S P A-20000)对蛇毒凝血酶样酶修饰条件的选择
反应温度的选择：取0.8m g/m l的降纤酶溶液2m l，加2m l磷酸盐缓冲液使溶液的p H值为6.5，再加入m P E G-S P A-20000固体8.0m g，溶解，混匀，各取0.3ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4℃、10℃、25℃和37℃反应30min 后终止反应。

比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的降纤酶，其中25℃的修饰率最高。

反应时间的选择：取0.8m g/m l的降纤酶溶液2m l，加2m l磷酸盐缓冲液使溶液的p H值为6.5，再加入m P E G-S P A-20000固体8.0m g，溶解，混匀，各
取0.3m l置于4支带塞试管中，然后于25℃分别反应5、15、30、60、120m i n 后终止反应。

比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的降纤酶，其中30min后的修饰率没有明显提高。

降纤酶同m P E G-S P A-20000的摩尔比的选择：取0.8m g/m l的降纤酶溶液2 m l，加2m l磷酸盐缓冲液使溶液的p H值为6.5，各取0.3m l置于4支带塞试管中，然后分别加入mPEG-SPA-20000固体0.0067、0.067、0.67、6.7mg(分别相当于降纤酶同mPEG-SPA-20000的摩尔比在1∶0.1、1∶1、1∶10、1∶100)，溶解，混匀，反应30m i n后终止反应。

比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的降纤酶，当降纤酶同m P E G-S P A-20000的摩尔比在1∶10时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-SPA-20000的量修饰率也没有明显地增加。

反应p H值的选择：各取0.1m g/m l的降纤酶溶液2m l，置于6支带塞试管中，分别加2ml不同pH值的磷酸盐缓冲液使溶液的pH值为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，再加入mPEG-SPA-20000固体1.10mg，溶解，混匀，于25℃反应30min 后终止反应。

比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些条件均能得到聚乙二醇修饰的降纤酶，其中pH值为6.5时修饰率最高。

分别用安可洛酶、巴曲酶和蕲蛇酶替换降纤酶按如上的方法进行反应温度的选择、反应时间的选择、蛇毒凝血酶样酶同m P E G-S P A-20000的摩尔比的选择和反应pH值的选择的试验，结果表明，这三种酶在25℃、反应时间为30min，pH值等于6.5，摩尔比1∶10均得到了相同的最佳修饰条件。

实施例2
聚乙二醇修饰降纤酶的分离纯化与鉴定
取1.1m g/m l的降纤酶溶液2m l，加约5m l的磷酸盐缓冲液使溶液的p H值
为6.5，再加入mPEG-SPA-20000固体12.2mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入3g甘氨酸固体终止反应。

取上述反应液，对0.05mol/L，pH 7.8的Tris-HCl缓冲液透析，用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5ml，上柱分离。

色谱条件如下：
层析介质：SOURCE 30Q
柱体积：5ml
流速：1.0ml/min
柱平衡：用0.05m o l/L，p H 7.8的T r i s-H C l(起始缓冲液)平衡5倍柱体积 上样量：5ml
洗脱：先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+1.0m o l/L N a C l缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV
收集：1.0ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的降纤酶，再用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5m l，待做凝胶过滤层析分离。

凝胶过滤层析的色谱条件如下：
层析填料：Superdex 75pre grade
柱规格：1.6×60cm
流动相：0.05M N a2H P O4-N a H2P O4，p H 7.0，含0.15m o l/L N a C l 流速：0.3ml/min
检测波长：215nm
收集：0.5ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并单聚乙二醇修饰的降纤酶。

S D S-P A G E分析表明得到的聚乙二醇修饰的降纤酶的分子量比降纤酶的分子量大20000，在56000D a左右。

R P-H P L C分析表明得到的聚乙二醇修饰的降纤酶的纯度在95％以上，具有较高的纯度。

聚乙二醇修饰的降纤酶经MALDI-TOF-MS分析，测得其分子量为52360.2(降纤酶的分子量为33691.0)，二者分子量相差约20000，这也证实得到的聚乙二醇修饰的降纤酶为单修饰产物，同时在52361(M+1峰)附近有一系列峰，相邻两峰的分子量相差44，具有聚乙二醇的典型结构特征。

分别对降纤酶和聚乙二醇修饰的降纤酶进行N末端氨基酸测序分析，结果聚乙二醇修饰的降纤酶的N末端氨基酸测不出，这表明聚乙二醇修饰的位点是降纤酶的N末端NH2基。

实施例3
聚乙二醇修饰安可洛酶的分离纯化与鉴定
取0.8m g/m l的安可洛酶溶液2m l，加约5m l的磷酸盐缓冲液，使溶液的p H值为6.5，再加入m P E G-S P A-20000固体9.1m g，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入3g甘氨酸固体终止反应。

取上述反应液，对0.05mol/L，pH 8.3的Tris-HCl缓冲液透析，用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5ml，上柱分离。

色谱条件如下：
层析介质：SOURCE 30Q
柱体积：5ml
流速：1.0ml/min
柱平衡：用0.05m o l/L，p H 8.3的T r i s-H C l(起始缓冲液)平衡5倍柱体积 上样量：5ml
洗脱：先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+1.0m o l/L N a C l缓冲液(B)，B从
0～100％，洗脱20倍CV
收集：1.0ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的安可洛酶，再用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5m l，待做凝胶过滤层析分离。

凝胶过滤层析的色谱条件如下：
层析填料：Superdex 75pre grade
柱规格：1.6×60cm
流动相：0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0，含0.15mol/L NaCl
流速：0.3ml/min
检测波长：215nm
收集：0.5ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并单聚乙二醇修饰的安可洛酶。

S D S-P A G E分析表明得到的聚乙二醇修饰安可洛酶的分子量比安可洛酶的分子量大20000，在55000D a左右。

R P-H P L C分析表明得到的聚乙二醇修饰的降纤酶的纯度在97％以上，具有较高的纯度。

分别对安可洛酶和聚乙二醇修饰的安可洛酶进行N末端氨基酸测序分析，结果聚乙二醇修饰的安可洛酶的N末端氨基酸测不出，这表明聚乙二醇修饰的位点是安可洛酶的N末端N H2基。

实施例4
聚乙二醇修饰巴曲酶的分离纯化与鉴定
取0.9m g/m l的巴曲酶溶液2m l，加约5m l的磷酸盐缓冲液，使溶液的p H 值为6.5，再加入mPEG-SPA-20000固体8.6mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入3g甘氨酸固体终止反应。

取上述反应液，对0.05mol/L，pH 9.0的Tris-HCl缓冲液透析，用截流分子
量为10000的超滤膜浓缩至5ml，上柱分离。

色谱条件如下：
层析介质：SOURCE 30Q
柱体积：5ml
流速：1.0ml/min
柱平衡：用0.05m o l/L，p H 9.0的T r i s-H C l(起始缓冲液)平衡5倍柱体积 上样量：5ml
洗脱：先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+0.2m o l/L N a C l缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV
收集：1.0ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的巴曲酶，再用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5m l，待做凝胶过滤层析分离。

凝胶过滤层析的色谱条件如下：
层析填料：Superdex 75pre grade
柱规格：1.6×60cm
流动相：0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0，含0.15mol/L NaCl
流速：0.3ml/min
检测波长：215nm
收集：0.5ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并单聚乙二醇修饰的巴曲酶。

S D S-P A G E分析表明得到的聚乙二醇修饰巴曲酶的分子量比巴曲酶的分子量大20000，在62000D a左右。

R P-H P L C分析表明得到的聚乙二醇修饰的巴曲酶的纯度在96％以上，具有较高的纯度。

分别对巴曲酶和聚乙二醇修饰的巴曲
酶进行N末端氨基酸测序分析，结果聚乙二醇修饰的巴曲酶的N末端氨基酸测不出，这表明聚乙二醇修饰的位点是巴曲酶的N末端NH2基。

实施例5
聚乙二醇修饰蕲蛇酶的分离纯化与鉴定
取1.2m g/m l的蕲蛇酶溶液2m l，加约5m l的磷酸盐缓冲液，使溶液的p H 值为6.5，再加入mPEG-SPA-20000固体17.8mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入3g甘氨酸固体终止反应。

取上述反应液，对0.05mol/L，pH 7.2的Tris-HCl缓冲液透析，用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5ml，上柱分离。

色谱条件如下：
层析介质：SOURCE 30Q
柱体积：5ml
流速：1.0ml/min
柱平衡：用0.05m o l/L，p H 7.2的T r i s-H C l(起始缓冲液)平衡5倍柱体积 上样量：5ml
洗脱：先用3倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液(A)，起始缓冲液+1.0m o l/L N a C l缓冲液(B)，B从0～100％，洗脱20倍CV
收集：1.0ml/管
用S D S-P A G E和R P-H P L C进行跟踪分析，合并聚乙二醇修饰的蕲蛇酶，再用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至5m l，待做凝胶过滤层析分离。

凝胶过滤层析的色谱条件如下：
层析填料：Superdex 75pre grade
柱规格：1.6×60cm。