一株鸭源禽Ⅰ型副黏病毒毒力测定及诱导免疫应答研究

一株鸭源禽Ⅰ型副黏病毒毒力测定及诱导免疫应答研究
张济培;谭华龙;陈冈;曾强;张福英;陈建红
【摘要】试验旨在测定一株从番鸭中分离获得的禽Ⅰ型副黏病毒(GSFY株)的生物学特性和遗传特性,并将其制成油乳剂灭活疫苗,进行番鸭免疫保护试验.结果显示,GSFY株的平均致死时间(mean death time,MDT)为71 h,脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)为1.75,静脉接种致病指数(intravenous pathogenicity index,IVPI)为2.49;GSFY株F基因核苷酸序列同源性分析显示,其与鸡源Chicken/China/Guangxi 9/2003株同源性最高,为97.1%,且二者均处于基因Ⅶ型分支,综合以上结果确定其为禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型强毒株.免疫保护试验结果显示,疫苗进行3次免疫后对番鸭有良好的免疫保护效果,3次免疫后第7天抗体效价平均值达到6log2,第21天抗体效价平均值达到8log2,用GSFY毒株攻击免疫番鸭,当抗体滴度>5log2时,保护率达100%.本研究结果为生产实践制订鸭预防禽Ⅰ型副黏病毒病的免疫程序提供参考.%In this study,the biological and genetic characterization of a paramyxovirus type Ⅰ strain (GSFY strain) which was obtained from Muscovy duck were determined.Afterward,GSFY strain was developed as an inactivated oil emulsion vaccine.The protective evaluation of this new vaccine candidate was conducted on the Muscovy duck.The results showed that the mean death time (MDT) of chicken embryo,the intracerebral pathogenicity index (ICPI) of 1-day-old chicken and the intravenous pathogenicity index (IVPI) in 6-week-old chicken were 71 h,1.75 and 2.49, respectively.Homologous comparison of F gene nucleotide sequence showed that the GSFY strain shared 97.1% with Chicken/China/Guangxi 9/2003,which was the highest
homology,and they all belonged to type Ⅶ.Th e results suggested that this newly isolated strain was the type Ⅶ high virulent paramyxovirus.The immunize protective evaluation results suggested that the mean antibody titer of 7 and 21 days after the third immunization were 6log2 and
8log2,respectively.When the immunized duck were attacked with GSFY strain,100% protective rate could be expected when the mean antibody titer was above 5log2.This study provided the basic data for vaccine development of avian type Ⅰ paramyxovirus.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2017(044)004
【总页数】7页(P1168-1174)
【关键词】鸭源禽Ⅰ型副黏病毒;生物学特性;遗传特性;油乳剂灭活疫苗
【作者】张济培;谭华龙;陈冈;曾强;张福英;陈建红
【作者单位】佛山科学技术学院生命科学院,佛山 528231;佛山科学技术学院生命科学院,佛山 528231;佛山科学技术学院生命科学院,佛山 528231;佛山科学技术学院生命科学院,佛山 528231;佛山科学技术学院生命科学院,佛山 528231;佛山科学技术学院生命科学院,佛山 528231
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
野生水禽一直被认为是禽Ⅰ型副黏病毒的天然储藏库，感染不同型弱毒力的禽Ⅰ型副黏病毒的野生水禽并不表现出任何的临床症状，然而有相关研究报告显示，很多
强毒毒株是由弱毒毒株起源的[1-4]。

鸭Ⅰ型副黏病毒病是以呼吸道、消化道黏膜
出血为典型症状的急性、高度接触性及高度致死性传染病，是目前严重危害鸭养殖业的主要疫病之一。

随着鸭养殖规模的不断扩大，该病的发生率呈上升趋势。

目前，预防该病的有效方法是免疫接种，但大量流行病学调查数据显示[5-8]，当前中国
水禽Ⅰ型副黏病毒的优势流行株为基因Ⅶ型，与目前国内普遍使用的新城疫疫苗的毒株在遗传距离上相差较远。

Dinapoli等[9]和Dortmans Jos等[10]研究发现，
用不同基因型毒株制成的灭活疫苗免疫效果优于LaSota株单价灭活油乳苗，因此传统的疫苗并不能为水禽提供完全的免疫保护，而使用与当前流行毒株基因型一致的疫苗对防控鸭Ⅰ型副黏病毒病具有很大优势和潜力。

为此，本研究对一株鸭源禽Ⅰ型副黏病毒的生物学特性和F基因序列进行分析，并将该毒株制成油乳剂灭活
疫苗，进行番鸭免疫保护试验，检测该毒株油乳剂灭活苗诱导免疫应答能力和免疫保护效果，旨在为防控鸭感染禽Ⅰ型副黏病毒提供理论依据。

1.1 材料
1.1.1 毒株禽Ⅰ型副黏病毒GSFY株从番鸭病例中分离获得，由佛山科学技术学
院生命科学学院禽病研究所保存。

1.1.2 试验动物 9日龄SPF鸡胚购自肇庆大华农生物药品有限公司；1日龄和6
周龄雏鸡(各15只)购自南海联营种鸡场；1、30、40和50日龄健康番鸭分别为44、10、24和10只，均购自佛山市顺德区某种番鸭场。

1.1.3 主要试剂 Trizol Reagent购自Invitrogen公司；柱式DNA胶回收试剂盒
和UNIQ-10柱式病毒RNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pMD18-T载体和大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自TaKaRa公司。

1.2 GSFY株生物学特性分析
1.2.1 鸡胚平均致死时间(MDT) 将GSFY株病毒液用灭菌生理盐水进行10倍倍比稀释，每个稀释度分别接种5枚10日龄的鸡胚，每胚接种0.1 mL，37 ℃孵育。

每天观察鸡胚，连续观察7 d，记录每个禽胚的死亡时间，每天收集死胚于4 ℃冰箱保存。

7 d后收集所有鸡胚的尿囊液，作HA效价测定，参考世界卫生组织(OIE)的标准对GSFY株病毒液进行MDT的测定和计算。

1.2.2 1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI) 将GSFY株病毒液用灭菌生理盐水进行10倍倍比稀释，脑内接种出壳后24 h的雏鸡10只，0.05 mL/只，设脑内接种生理盐水雏鸡(10只，0.05 mL/只)为对照组。

每天观察并对试验雏鸡进行评分，正常鸡记0分，发病鸡记1分，死亡鸡记2分，连续观察8 d，参考世界卫生组织(OIE)的标准对GSFY株病毒液进行ICPI的测定和计算。

1.2.3 6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI) 将GSFY株病毒液用灭菌生理盐水进行10倍倍比稀释，经翅静脉接种6周龄鸡各10只，0.1 mL/只，设立注射生理盐水6周龄鸡(10只，0.1 mL/只)为对照组。

每天观察并对试验雏鸡进行评分，正常鸡记0分，发病鸡记1分，瘫痪鸡或呈其他神经症状鸡记2分，死亡鸡记作3分，连续观察10 d，参考世界卫生组织(OIE)的标准对GSFY株病毒液进行IVPI的测定和计算。

1.2.4 半数致死量(DLD50)的测定将GSFY株病毒液用PBS作连续10倍稀释至10-10，每个稀释度经胸肌注射7只42日龄番鸭，0.5 mL/只，以同样剂量灭菌生理盐水注射7只番鸭作为空白对照组，按Reed-Muench氏法计算DLD50。

1.2.5 致病性试验用GSFY株第3代病毒液分别攻毒5只30、40和50日龄无新城疫母源抗体的健康鸭，肌注0.5 mL病毒液，并各取5只同日龄鸭作为对照组，对照组胸肌注射灭菌生理盐水0.5 mL。

观察并记录发病鸭的死亡数、临床症状和剖检病变。

1.3 GSFY株遗传特性分析
1.3.1 引物设计与合成根据GenBank中已发表的新城疫F基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，引物序列：F：5′-
TTAGAAAAAACACGGGTAGAAG-3′；R：5′-GTTGCACTCACACTGCA-3′，预
计片段长度为2 653 bp。

引物由上海英骏生物科技有限公司合成。

1.3.2 RT-PCR扩增按照Invitrogen公司Trizol Reagent RNA Kit的使用说明书提取病毒RNA，并按照Reverse Transcriptase XL (AMV)使用说明书进行反转录，反转录产物进行PCR扩增。

PCR扩增体系25 μL：2×PCR Master Mix(含
2×Taq DNA聚合酶、2×PCR Buffer 和2×dNTP)10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板4 μL，ddH2O 10 μL。

PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 F基因同源性分析将PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆
菌DH5α感受态细胞，将经PCR鉴定为阳性的菌液送英潍捷基生物有限公司进行序列测定。

测序结果用DNAStar中的EditSeq和SeqMan程序进行拼接和分析。

选取GenBank中已发表的新城疫病毒(NDV) F基因(表1)的核苷酸序列进行同源
性分析，并绘制系统发生树。

1.4 GSFY株油乳剂灭活疫苗的制备
在10%甲醛溶液中加入GSFY株病毒液，至甲醛终浓度为0.1%，充分混匀后，
37 ℃灭活16 h。

灭活结束后，随机抽取抗原液进行检验，接种10枚9日龄非免疫鸡胚，0.2 mL/枚，37 ℃恒温孵育，若鸡胚全部存活，收集鸡胚尿囊液，检测
尿囊液无血凝性时为灭活合格。

按《兽医生物制品学》[11]方法将灭活液制成油乳灭活疫苗，并按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》[12]方法检测疫苗的理化性状，待检测合格后，4 ℃保存待用。

1.5 免疫接种方案
44只1日龄雏番鸭饲养7 d后分成4组。

A组番鸭在7日龄时肌肉注射GSFY株油乳剂灭活疫苗，0.4 mL/只；B组番鸭分别于7和14日龄时肌肉注射GSFY株
油乳剂灭活疫苗，剂量依次为0.4和0.6 mL/只；C组番鸭于7、14、21日龄时
肌肉注射GSFY株油乳剂灭活疫苗，剂量依次为0.4、0.6和1.0 mL/只；D组为
非免疫组。

各组雏鸭免疫前、后每周经颈静脉采血，分离血清，测定HI抗体水平。

1.6 免疫保护试验
将雏番鸭按抗体水平分成5组：1组：3log2≥HI>0，2组：4log2≥HI>3log2，
3组：5log2≥HI>4log2：4组：6log2≥HI>5log2，5组：9log2≥HI>6log2；
6组和7组为HI为0的非免疫番鸭。

1～6组番鸭分别用GSFY株病毒液肌肉注射攻毒，依据DLD50测定结果，注射量为0.5 mL/只；第7组番鸭肌肉注射灭菌生理盐水0.5 mL/只。

观察10 d，记录各组番鸭发病、死亡情况和病变情况；将未
死亡的鸭处死后检查病理变化。

2.1 致病指数
GSFY株MDT为71 h，ICPI为1.75，IVPI为2.49，按Reed-Muench氏法计算GSFY株对42日龄番鸭的DLD50为10-7.86/0.5 mL，参照OIE标准判断GSFY
株属于强毒株。

2.2 致病性试验
GSFY株病毒液攻毒48 h后番鸭开始发病，144 h后全部死亡。

病鸭表现为精神
沉郁、嗜睡，头部羽毛松乱，头部震颤、摇头或扭颈等神经症状，拉青绿色稀粪。

死亡时间集中在72～120 h，剖检死亡鸭可见脑充血和少量出血点，腺胃乳头出血，肠黏膜充血、出血，部分病死鸭肝脏淤血或局灶性出血，胰脏有灰白色点状变性坏死，脾脏斑驳状病变，与自然发病鸭群的剖检结果基本一致。

2.3 GSFY株F基因RT-PCR扩增结果
RT-PCR扩增结果见图1。

由图1可知，经1.0%凝胶电泳后出现约为2 653 bp
的片段，与预期片段大小相同。

序列分析显示，GSFY株鸭源禽Ⅰ型副黏病毒的F
基因开放性阅读框长度为1 662 bp，F蛋白裂解位点处氨基酸组成为112R-R-Q-
K-R-F117，具有禽Ⅰ型副黏病毒强毒株典型分子特征，与毒力检测结果一致。

2.4 F基因同源性分析
由图2可知，GSFY株F基因与国内的标准疫苗株lasota F基因的同源性为83.6%，与鸡源的Chicken/China/Guangxi 9/2003、HA-14-07-Ch、HA-9-06-Ch、HA-20-07-Ch株F基因的同源性分别为97.1%、96.2%、95.7%和95.7%，与鸭源的NDV09-057、NDV10-006、NDV10-012、NDV10-060株F 基因的同源性分别为70.4%、70.9%、70.3%和70.9%，而与鸽源的
Pigeon/China/107/08、Pigeon/China/110/08、Pigeon/China/112/08、Pigeon/China/KP/114/08株F基因的同源性分别为88.4%、88.1%、88.1%和83.6%。

2.5 F基因遗传进化树
将GSFY株F基因序列与已发表的NDV F基因相关代表序列进行比对，应用DNAStar分析并绘制系统进化树,结果见图3。

由图3可知，GSFY株与鸡源的Chicken/China/Guangxi 9/2003株亲缘关系最近，与HA-14-07-Ch、HA-9-06-Ch、HA-20-07-Ch株聚为一类，均处于基因Ⅶ型分支,而其与NDV09-057、NDV10-006、NDV10-012、NDV10-060株的亲缘关系较远。

2.6 GSFY株疫苗对鸭免疫应答情况
各组的番鸭HI抗体检测结果见图4。

由图4可知，GSFY株油乳剂灭活疫苗免疫番鸭后，3组抗体水平都在42 d达到峰值，但是抗体水平峰值各不相同，进行3次免疫的抗体水平最高，抗体效价平均值达到8log2；仅进行1次免疫的抗体水平最低，抗体效价平均值达到5log2。

2.7 免疫保护试验
各组番鸭攻毒24 h后，6组有个别鸭出现精神沉郁、废食、蹲伏及摇头等症状，48 h后第1、2、3组也陆续出现该病症。

6组病番鸭于36 h后陆续出现死亡，而第4、5和7组(对照组)无肉眼可见症状。

4、5和7组中死亡番鸭数为0，而6
组中番鸭全部死亡，死亡率为100%，1、2和3组中番鸭死亡率分别为28.57%、42.86%和28.57%(表2)。

本研究结果发现，GSFY株MDT为71 h，ICPI 为1.75，IVPI为2.49，毒力检测结果显示GSFY株属于强毒株。

经RT-PCR扩增GSFY株F基因后，序列分析毒
株F蛋白裂解位点处氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117，具有NDV强毒株典型分子特征，与毒力检测结果一致。

同源性分析表明，GSFY株F基因与鸡源的Chicken/China/Guangxi 9/2003株的同源性最高为97.1%，但与鸭源的毒株F
基因的同源性最高仅为70.9%(NDV10-006和NDV10-060株)。

出现这种情况,
一方面可能是由于各种禽类混养、散养现象普遍存在，特别是散养户，鸡和水禽在同一区域内混养，使得水禽与鸡直接密切接触，从而为病毒在不同禽类间传播提供了基础，形成了一个天然的循环库;另一方面可能是由于病毒在不同种属的宿主间
传播，使其承受不同宿主的选择压力，从而形成点突变，使病毒毒力升高，最终导致强毒株的形成[13-14]。

目前，预防水禽Ⅰ型副黏病毒病的方法主要是接种鸡新城疫疫苗[15]。

大量研究结果显示，当前国内从鸭分离得到禽Ⅰ型副黏病毒的优势流行株属于基因Ⅶ型，与传统新城疫疫苗株的基因型在遗传距离上相差较远[16-18]，陈延芝等[19]和马晓丹[20]试验结果显示，使用传统的新城疫疫苗对鸭进行免疫，并不能使其抵御不同基因型强毒株的攻击。

本研究用GSFY株油乳剂灭活疫苗对番鸭免疫后检测番鸭血清的HI抗体水平。

结果显示，3组番鸭在免疫后第1周产生免疫应答，至第6周抗体水平均达到最高，各组抗体水平最高值分别为5log2、6.64log2和8log2。

免
疫保护试验结果显示，当番鸭的抗体水平≤5log2时，用GSFY株攻毒有番鸭发病甚至死亡，病理剖检可见不同程度的病理变化;当番鸭的抗体水平>5log2时，番鸭无肉眼可见症状，保护率达100%。

张秀峰[21]和路振香等[22]用分离得到的禽Ⅰ型副黏病毒制成疫苗并进行免疫，并用分离毒株进行攻毒免疫动物，当抗体水平
≥6log2时，动物保护率达100%，与本试验结果一致。

上述结果表明，鸭接种GSFY株油乳剂灭活疫苗应进行3次免疫较为合适，此时不仅能让鸭产生良好的免疫应答，保护率达100%，而且可以在较长的时间内维持较高的抗体滴度，延长动物保护时长。

目前，国家有关部门尚无正规的鸭副黏病毒病疫苗产品，本试验的GSFY株油乳剂灭活疫苗研究可为广东部分地区的鸭Ⅰ型副黏病毒的免疫预防和在生产实践中制定鸭Ⅰ型副黏病毒病免疫程序提供理论依据。

研究结果显示，GSFY株为禽Ⅰ型副黏病毒基因Ⅶ型强毒株，且用GSFY株制作的油乳剂灭活疫苗对番鸭进行3次免疫后有良好的免疫保护效果，本研究结果可为
生产实践中制订鸭预防禽Ⅰ型副黏病毒病的免疫程序提供参考。

*通信作者：陈建红(1958-)，男，广东高州人，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：预防兽医学，E-mail：************************
【相关文献】
[1] 崔洁，王玮琳，王伟利，等.新城疫病毒毒力的演化研究进展[J].安徽农业科学，2013，41(24)：9988-9990.
[2] 于洋，封振，何孔旺，等.新城疫病毒毒力分子机制研究进展[J].江苏农业学报，2013，29(2)：435-439.
[3] Paldurai A，Kim S H，Nayak B，et al. Evaluation of the contributions of the individual viral genes to Newcastle disease virus virulence and pathogenesis[J].Journal of Virology，2014，88(15)：8579-8596.
[4] Vickers M L，Hanson R P. Newcastle disease virus in waterfowl in Wisconsin[J].Journal of Wildlife Diseases，2014，18(2)：149-158.
[5] 张训海，朱鸿飞，陈溥言，等.鸭副黏病毒强毒株的分离和鉴定[J].中国动物检疫，2001，
18(10)：24-26.
[6] 孙杰，刁有祥，李建侠，等.10株鸭源新城疫病毒的分离鉴定及F基因遗传进化分析[J].畜牧兽医学报，2010，41(8)：1054-1060.
[7] 吴焕荣，刁有祥，李宏梅，等.鸭源副黏病毒的致病性试验[J].中国兽医学报，2011，31(1)：
36-39.
[8] Wang Y Y，Duan Z Q，Hu S L，et al. Lack of detection of host associated differences
in Newcastle disease viruses of genotype Ⅶ isolated from chickens and geese[J].Virology Journal，2012，9(1)：197.
[9] Dinapoli J M，Ward J M，Cheng L，et al. Delivery to the lower respiratory tract is required for effective immunization with Newcastle disease virus-vectored vaccines intended for humans[J].Vaccine，2009，27(10)：1530-1539.
[10] Dortmans Jos C F M， Peeters Ben P H，Koch G.Newcastle disease virus outbreaks：Vaccine mismatch or inadequate application[J].Veterinary Microbiology，2012，160(1-2)：17-22.
[11] 姜平.兽医生物制品学[M].第2版.北京：中国农业出版社，2003.
[12] 中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品质量标准[M].北京：中国农业出版社，2001.
[13] Gould A R，Kattenbelt J A， Selleck P，et al. Virulent Newcastle disease in Australia：Molecular epidemiological analysis of viruses isolated prior to and during the outbreaks
of 1998-2000[J].Virus Res，2001，77(1)：51-60.
[14] 段志强，许厚强，嵇辛勤，等.贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究[J].
畜牧兽医学报，2016，47(8)：1623-1634.
[15] 武发菊，刘学荣，尚勇良，等.新城疫疫苗的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38(10)：
145-148.
[16] Calnek B W. Diseases of Poultry[M].10th edition. USA：Iowa state university Press，1998.
[17] 刘华雷，王志亮，吴延功，等. 2005年中国新城疫病毒分子流行病学研究[J].畜牧兽医学报，2006，37(12)：1340-1344.
[18] 丁壮，尹仁福，薛聪，等.新城疫流行病学新特点及鹅新城疫防控策略[J].中国兽医学报，2015，35(1)：159-168.
[19] 陈延芝，庄志伟，罗炳强.应用新城疫弱毒疫苗与灭活疫苗防制鸭副黏病毒病的探索[J].养禽与
禽病防治，2011，3：35-37.
[20] 马晓丹.鹅源新城疫病毒自然弱毒株的分离、鉴定与免疫效果观察[D].扬州：扬州大学，2007.
[21] 张秀峰. 鸭副黏病毒病诊断与同源疫苗的研制及初步应用[D].长春：吉林大学，2013.
[22] 路振香，张训海，商常发，等.鹅副黏病毒油乳剂灭活疫苗的研制[J].畜牧兽医杂志，2006，
25(4)：13-15.。