缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响
侯洋;史建刚;袁文
【摘要】目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响.方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+ PRP组(A组)、常氧BMP-2+ BMSCs+ PRP组(B组)、低氧BMSCs+ PRP组(C组)、低氧BMP-2+ BMSCs+ PRP组(D组).反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达.结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升
高.Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高.所有结果差异均有统计学意义(P＜0.05).结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化.HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs 成软骨细胞分化的作用.
【期刊名称】《脊柱外科杂志》
【年(卷),期】2016(014)002
【总页数】5页(P101-105)
【关键词】细胞低氧;骨形态发生蛋白质类;间质干细胞;骨髓;细胞分化;兔
【作者】侯洋;史建刚;袁文
【作者单位】第二军医大学附属长征医院脊柱外科,上海200003;第二军医大学附
属长征医院脊柱外科,上海200003;第二军医大学附属长征医院脊柱外科,上海200003
【正文语种】中文
【中图分类】R329.28
椎间盘退变作为引起下腰痛症状的主要病因已成为脊柱外科临床面临的常见问题之一，同时椎间盘退变又是腰椎椎间盘突出症、腰椎椎管狭窄症等脊柱退变性疾病的病理基础，严重影响患者生活质量。

目前临床对于腰椎椎间盘突出症的治疗包括非手术治疗和手术治疗，然而不管何种治疗方式，均不能从根本上阻遏椎间盘退变的进展，且存在各种治疗风险及局限性。

随着再生医学的飞速发展，通过组织工程学方法从根本上阻遏甚至治愈椎间盘退变已逐渐成为可能。

本研究组在之前的研究中已经证实骨形态发生蛋白-2（BMP-2）转染的骨髓间充质干细胞（BMSCs）与富血小板血浆（PRP）凝胶相复合可以在
兔退变椎间盘中分化为类髓核细胞，进而修复兔椎间盘退变［1］。

然而BMP-2
是通过何种机制诱导BMSCs分化为类髓核细胞的尚不明确。

BMP-2作为转化生
长因子-β（TGF-β）超家族的一员，能够诱导BMSCs进行成骨或成软骨分化。

目前，对于BMP-2的研究主要集中在成骨诱导分化上。

组织胚胎学分化的研究表明成骨分化与成软骨分化是一个连续的过程，首先BMSCs细胞聚集形成类软骨组织，接下来BMSCs的分化方向取决于血管是否长入，长入的血管结构能够为类软骨组织提供足够的氧气，进而推动BMSCs继续向成骨方向分化；反之，BMSCs便停
留在软骨分化状态［2］。

成人的椎间盘组织是无血管的，其营养供应主要是经软骨终板中央区营养物质的弥散来完成［3］。

因此，由于缺血而引起的低氧状态便构成了退变椎间盘组织中局部微环境的重要特征。

而研究低氧状态下BMP-2对BMSCs诱导分化的影响对于明确BMP-2在椎间盘退变基因治疗中的作用机制以及优化椎间盘退变组织工程学的治疗方案均具有十分重要的意义。

1.1 兔BMSCs的分离培养及纯化
4周龄纯种新西兰大白兔1只，体质量1.0 kg（第二军医大学实验动物中心提供），30.0 g/L戊巴比妥钠按1.0 mL/kg剂量经兔耳缘静脉行全身麻醉。

常规消毒铺巾，于双侧胫骨近端作骨穿。

穿刺成功后用含有0.5 mL肝素钠盐水的注射器抽取骨髓4.0～5.0 mL。

将骨髓转移至离心管，再加入等量的PBS洗涤后在转速1 000 r/min、离心半径20.0 cm条件下离心5 min。

弃去上清液，加入培养基重悬后接种于100.0 mL的培养瓶中，于37℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养。

培养3 d后全量换液，去除悬浮细胞。

原代培养细胞长满瓶底面积80.0%～90.0%时，加入2.5 g/L胰蛋白酶0.5 mL并消化2～3 min，加入含有血清的LG-DMEM培养基终止消化。

在转速1 000 r/min、离心半径20.0 cm条件下离心5 min，弃上清液，吹打细胞后以1∶3接种，光镜下观察细胞生长状态，见图1。

1.2 PRP的制备
成年新西兰白兔肌肉注射戊巴比妥钠麻醉后，无菌条件下耳缘静脉取血5.0 mL，用10.0%枸橼酸钠葡萄糖溶液0.3～0.5 mL预防凝血。

采血样本在转速2400
r/min、离心半径20.0 cm条件下离心10 min，取上层血清和交界层1.0 mm血细胞层，置于另一支无菌离心管中在转速3 600 r/min、离心半径20.0 cm条件下离心15 min，得到离心管底部黄褐色约0.5 mL的PRP。

将3 000 U牛凝血酶溶解于3.0 mL质量浓度为5.0 g/L的CaCl2溶液中，作为激活PRP凝聚成凝胶
的激活剂。

1.3 BMSCs与PRP凝胶的复合及转染
取适量的第三代BMSCs与PRP混合成终浓度为1×108/mL的BMSCs细胞悬液，随后加入激活剂（60 U牛凝血酶+1.0 mL 10.0% CaCl2/10.0 mL PRP）制成细胞凝胶复合物，细胞用含3% FBS的H-DMEM培养基培养，每3 d换液一次。

其
中BMP-2转染组于H-DMEM培养基中加入0.2 mg/L的BMP-2［4］，使其最
终浓度达到0.2 mg/L。

1.4 实验分组
实验设立常氧BMSCs + PRP组（A组）、常氧BMP-2 + BMSCs + PRP组（B 组）、低氧BMSCs +PRP组（C组）、低氧BMP-2 + BMSCs + PRP组（D 组）。

以上每组6个样本，共24个样本量，其中每组3个（共12个）样本用于
反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测，另外12个样本用于Western-blotting检测。

1.5 低氧组模型的制备
将装有BMSCs+PRP或BMP-2+BMSCs+PRP混合物的六孔板放置于密闭性良好的缺氧箱中，通过气体适配器将输入O2体积分数调整至3%（总气体流量为2 000 mL/min，O2流量为60 mL/min），将3%的低氧混合气体输入缺氧箱中作用5 min后将其密封移入细胞培养箱（温度37℃，CO2体积分数5%，湿度100%）中，细胞培养液选用高糖培养基（3% FBS以及1% P/S）。

每3 d进行
细胞换液，每次换液后重新将六孔板置于缺氧箱中并重新进行混合气体的输注，方法同前，之后将缺氧箱重新密封后置于细胞培养箱中。

1.6 RT-PCR检测
培养21 d后RT-PCR检测各组中成骨及成软骨分化基因的表达。

采用Trizol法提取各组总RNA，应用Takara公司反转录试剂盒，按说明书进行mRNA反转录。

分别进行Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原，蛋白聚糖，碱性磷酸酶（ALP）、runt相关转录
因子2（Runx2）及低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因聚合酶反应。

其中成骨检测基因为Ⅰ型胶原、ALP及Runx2；成软骨检测基因为Ⅱ型胶原及蛋白聚糖。

逆转
录条件：变性（40个循环，95.℃，30 s），退火（60.℃，30 s），延长（72.℃，60 s）。

采用GAPDH作为内参，逆转录反应的引物序列见表1。

熔解曲线分析未发现非特异性扩增。

1.7 Western-blotting检测
培养21 d后分别收集各组标本并将其加入包含有裂解缓冲液的Eppendorf管中，再向各管中加入蛋白提取液。

将收集的混合液移入新的Eppendorf管中进行离心［4℃，1.3×104×g（g=9.81 m/s2），10 min］，离心后移去上层及下层液体。

向管中加入无水乙醇后再次进行离心并移去管中的液体成分，加入3% SDS溶液。

蛋白煮沸10 min进行变性后进行蛋白的定量分析检测。

分别将50 ng的各组样
本溶液加入SDS-PAGE凝胶上样孔中，同时加入分子标记。

跑胶后将蛋白转移至PVDF膜上。

封闭后，加1∶500的Ⅱ型胶原，HIF-1α或SOX-9一抗，4℃过夜
后加入1∶10 000二抗孵育2 h，之后经显色、定影、扫描、灰度分析，根据相应条带判断蛋白表达的情况。

内参对照采用β-actin。

1.8 统计学处理
应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，各组数据均采用Kruskal-Wallis H检验；各组数据间的两两比较，采用Nemenyi检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

RT-PCR检测结果见图2。

C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和HIF-1α表达均较
A组和B组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；A组与B组之间，C组与
D组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

成骨分化相关基因Ⅰ型胶原、ALP在B
组的表达最高，其余3组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

A组与B组的Runx2表达较C组与D组升高，差异有统计学意义（P<0.05）；A组与B组之
间，C组与D组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

Western-blotting检测结果见图3，4。

B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C
组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；A组的Ⅱ型胶原表达又明显低于C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B组与D组Ⅱ型胶原表达差异无统计学意义（P>0.05）。

C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；C组与D组之间，A组与B组之间差异无统计学意义
（P>0.05）。

A组的SOX-9表达低于其余3组，差异有统计学意义（P<0.05）；D组的SOX-9表达高于其余3组，差异有统计学意义（P<0.05）；B组与C组
的SOX-9表达差异无统计学意义（P>0.05）。

自Pittenger等［5］报道BMSCs具备体外分化为软骨细胞的能力以来，BMSCs 已被证实可以在体外特定的培养体系下，通过细胞因子的诱导和转基因的方法提高蛋白多糖和Ⅱ型胶原的分泌，进而分化成为类软骨细胞。

而髓核细胞被认为与软骨细胞具有同源性，其在细胞形态和细胞外基质表达方面与软骨细胞相类似。

TGF-β超家族包含20多种BMP，其中BMP-2、4、6、7、13、14均可刺激软
骨细胞增殖、合成并分泌细胞外基质成分—蛋白多糖和Ⅱ型胶原，其中以BMP-2 刺激软骨形成的能力最强［6］。

Sekiya等［7］对比了BMP-2，4和6对人BMSCs诱导成软骨分化作用发现，BMP-2作用最强，进一步的基因芯片数据分
析显示，添加了BMP-2的BMSCs能够按正常生理形式和时间顺序表达软骨合成相关基因。

本研究组前期的动物实验研究亦已证实BMP-2可以体内促进BMSCs
的成软骨分化从而减缓椎间盘退变的程度［1］。

椎间盘组织工程研究的重要目标是通过再生医学的手段修复退变的髓核，从根本上逆转椎间盘退变的病理进程。

而目前最大的问题在于由无血管组织组成的椎间盘内部的低氧状态被认为不适宜进行组织的修复和再生。

而本研究通过体外模拟椎间盘的低氧条件来研究其对BMP-2诱导的BMSCs体外分化的影响，研究结果表明，
在低氧条件下BMP-2诱导的BMSCs成软骨分化明显占据了优势，而在此过程中成骨分化标志基因Runx2表达降低，提示成骨分化存在明显的抑制；在常氧条件
下成软骨分化则明显下降。

以上结果说明BMP-2转染的Ⅱ型胶原，蛋白聚糖细胞在椎间盘组织中能够进行成软骨的分化以形成类髓核细胞，这为BMP-2将来在椎间盘退变组织工程中的应用提供了理论依据。

有研究表明退变的椎间盘组织中可以检测到HIF-1α的表达，同时HIF-1α被认为在椎间盘细胞的存活以及退变椎间盘组织的再吸收中发挥重要作用［8］。

本研究采用了体积分数为3%的O2来模拟椎间盘退变组织中的低氧微环境，RT-PCR及Western-blotting检测均证实了低氧组中HIF-1α的表达较常氧组显著升高。

HIF-1α对BMP-2诱导的BMSCs成软骨细胞分化具有显著的促进作用，是成软
骨分化过程的重要调节因子。

为了进一步确定HIF-1α的可能作用机制，本研究对BMP-2的下游基因以及BMSCs成软骨分化的管家基因SOX-9的表达进行了测定。

结果表明低氧BMP-2组中的SOX-9表达明显升高。

据此可以推测在低氧条件下HIF-1α可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。

然而这一假设最终能否成立仍然需要后续研究进一步证实。

此外，在本研究中Ⅱ型胶原RT-PCR检测结果提示常氧条件下BMP-2转染组的表达低于低氧BMSCs组，而Western-blotting检测得出了相反的结果，本研究组经过多次实验测试得到了相同的结果，基本上排除了实验误差的可能。

2种检测方法结果不一致的可能原因：①mRNA与蛋白质的半衰期不同，mRNA极易降解，在组织内存在时间较短，而翻译成蛋白质后性质较稳定；本实验虽经多次测试，但尚不能完全排除样本中mRNA降解的可能性。

②RT-PCR检测mRNA的灵敏度
非常高，理论上只要有一个拷贝的目的基因即可检测到。

③在转录后，会有转录后加工，转录产物的降解，而翻译后亦存在加工及修饰好几个层面。

所以转录水平和翻译水平并不完全一致，且这种调节在不同蛋白质之间存在差异；低氧浓度可能主
要在转录水平促进了Ⅱ型胶原的表达，且尚不能排除低氧条件可能会抑制Ⅱ型胶原翻译后加工的可能性，这些均需在今后的研究中予以验证。

综上所述，低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化，同时抑制BMSCs的成骨分化。

HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子，其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。

［1］Hou Y，Shi G，Shi J，et al. Study design：in vitro and in vivo assessment of bone morphogenic protein 2 combined with plateletrich plasma on treatment of disc degeneration［J］. Int Orthop，2015，14.［Epub ahead of print］
［2］Pelttari K，Winter A，Steck E，et al. Premature induction of hypertrophy during in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stem cells correlates with calcification and vascular invasion after ectopic transplantation in SCID mice［J］. Arthritis Rheum，2006，54（10）：3254-3266.
［3］Urban JP，Smith S，Fairbank JC. Nutrition of the intervertebral disc ［J］. Spine（Phila Pa 1976），2004，29（23）：2700-2709.
［4］Lengner CJ，Lepper C，van Wijnen AJ，et al. Primary mouse embryonic fibroblasts：a model of mesenchymal cartilage formation［J］. J Cell Physiol，2004，200（3）：327-333.
［5］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］. Science，1999，284（5411）：143-147.
［6］Sánchez-Duffhues G，Hiepen C，Knaus P，et al. Bone morphogenetic protein signaling in bone homeostasis［J］. Bone，2015，
80：43-59.
［7］Sekiya I，Larson BL，Vuoristo JT，et al. Comparison of effect of BMP-2，-4，and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma［J］. Cell Tissue Res，2005，320（2）：269-276.
［8］Merceron C，Mangiavini L，Robling A，et al. Loss of HIF-1α in the notochord results in cell death and complete disappearance of the nucleus pulposus［J］. PLoS One，2014，9（10）：e110768.。