第三章发酵培养基

3、产物促进剂
产物促进剂：是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前 体，但加入后却能提高产量的添加剂。
提高产量的机制不完全清楚，其原因为： 有些促进剂本身是酶的诱导物；
有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。
不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响
废糖蜜和酒精贮存罐,最大罐体
糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的， 但许多都会对发酵产生不利的影响，需进行预处理。 例：谷氨酸发酵 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）
生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵
选择合适的无机氮源意义：
满足菌体生长
稳定和调节发酵过程中的pH
毛霉产蛋白酶的研究（陈涛，中国酿造，2004）
初始pH的影响: pH偏酸比较好， 中性蛋白酶影响 大
无机氮源的影响： 硫酸铵>硝酸铵> 硝酸钠>尿素
2、有机氮源
来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、 酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。
有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐 K4Fe(CN)6·3 H2O
③淀粉、糊精
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类
缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。
优点： 来源广泛、价格底 可以解除葡萄糖效应
三、按用途（从发酵生产应用考虑） 培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种
子培养基和发酵培养基三种
第二节 发酵培养基的成分及来源
一、碳源 1、作用 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成 菌体所必需的碳成分； 提供合成目的产物所必须的碳成分。
2、来源 糖类、油脂、有机酸、正烷烃
3、工业上常用的糖类
地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶
碳源对生长和产酶的影响
碳源 葡萄糖 蔗糖 糊精 淀粉
细胞量 4.2 4.02 3.06 3.09
α-淀粉酶 0 0
38.2 40.2
嗜热一氧化碳链 霉菌产纤维素酶
不同碳源对产酶的影响 Effect of different carbon source on cellulase production
必须进行表面处理
例：黑曲霉NRRL-330，生产α-淀粉酶，P对酶活的影响
pH
酶活
不加
4.25
120分钟
加 K2HPO4 加 KH2PO4
5.45
30分钟
4.62
75分钟
四、生长因子、前体和产物促进剂 1、生长因子
从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物 质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下∶
葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡算式为∶
C6H12O6 ─→ 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为∶
2*46
Y = ─── = 0.51
180
（二）实验设计
培养基成分的含量最终都是通过实验获得的 合理的实验方法
早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
有些产物会受氮源的诱导和阻遏 例： 蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣的 课题
不同氮源对QHS-X8 菌株产青蒿素的影响
不同氮源对嗜热一氧化碳链 霉菌产纤维素酶的影响 Effect of different nitrogen source on cellulase production
菌种的同化能力 代谢的阻遏和诱导: 100∶0.2～2.0 合适的C、N比 pH的要求
二、成分含量的确定 （一） 理论转化率与实际转化率
理论转化率是指理想状态下根据微生物的代 谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。
实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小
如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的 一个目标
PTT目前 性能最好 的纤维 被誉为21 世纪的大 型纤维
性能
柔韧度 弹性
丰满度 磨损 抗污染 力 洗涤牢 度 日晒牢 度 抗静电 力 色彩密 度
1、无机氮源
种类：氨盐、硝酸盐和氨水
特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮 源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：
(NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸 性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸 性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢 后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如 硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程 的pH有积极作用。
五、水
对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的， 因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢 影响甚大。
水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、 可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。
对于酿造行业，水的重要性不言而喻
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一 致清洁的水。
第三节 发酵培养基的设计和优化
成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无
机盐及生长因子。
例 玉米浆：
① 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ② 较多的乳酸 ③ 硫、磷、微量元素等
有机氮源原料的波动对发酵的影响： 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，
且有机氮源的来源具有不稳定性。
氮源使用的一些相关问题： 有机氮源和无机氮源应当混合使用
三、无机盐和微量元素
1、作用：各种不一样 2、来源：C、N源，以盐的形式补充 3、用量：根据具体的产品，以实验决定 4、使用注意点
A、 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑 B、使用时注意盐的形式（pH的变化）
例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20 μg/ml，发酵罐
摇瓶、反应器培养基研究的两个层次 摇瓶——培养基设计的第一步
反应器—最终优化的基础配方 例： 青霉素发酵
发酵摇瓶：玉米浆4%，乳糖10%，(NH4)SO4 0.8%，轻质碳 酸钙1% 发酵罐: 葡萄糖流加控制总量10-15%，玉米浆总量4-8%，补 加硫酸、前体等
摇瓶发酵培养基和罐的基础培养差别很大
如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型， 以生物素为生长因子, 生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有 较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生 长因子
2、前体
前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构 并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提 高。
多因子实验
多因子实验：均匀设计、 正交实验设计、 响应面分析等。
通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，采用多 元二次回归方程来拟合因素与响应值之间函数关系的一种统计 方法。
三、培养基设计的步骤
① 根据前人的经验和培养基成分确定一些必须考虑的 问题，初步确定可能的培养基成分；
② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；
第三章 发酵培养基
◆ 发酵培养基的基本要求 ◆ 发酵培养基的类型及功能 ◆ 发酵培养基的成分及来源 ◆ 发酵培养基的优化 ◆ 重组产品培养基的介绍
关键词：发酵，培养基，要求，类型及功能，成分及来源，优化
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞 生长所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为 微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。
实际使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素） 转化率为：13.8/[(0.337/0.6)*36]=68%
用法：前体使用时普遍采用流加的方法 主要原因： 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。苯乙
酸，一般基础料中仅仅添加0.07%
前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率
短小芽孢杆菌产青蒿素
李江华，无锡轻工大学学报，2004
嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响
苏勤，林业化学与工业，2004
结果：各种碳源相差不大 推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型
二、氮源
氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核 酸等）和含氮代谢物。
常用的氮源：有机氮源和无机氮源。
二、按状态
固体培养基: 适合于菌种和孢子的培养和保存，也广 泛用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产
半固体培养基: 即在配好的液体培养基中加入少量的琼 脂，一般用量为0.5%～0.8% ,主要用于微生物的鉴定。
液体培养基: 80%～90%是水，其中配有可溶性的或不 溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
作用：前体有助于提高产量和组份
用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有 个转化率的问题
例：6000 单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素＝6000*0.6（微克）＝3.6 mg/ml 苯乙酸＝（3.6*136）/356=1.38 mg/ml= 0.138%
③ 培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的 浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一 些合理的实验设计方法。
类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化 (郭秒,食品与工业发酵，2004) 类胡萝卜素的作用：色素、营养保健 原培养基:
初步确定可能的培 养基成分(以碳源为例)
单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)
摇瓶优化配方： 菌种筛选，反应器研究的基础
发酵罐：反应器水平, 可以得 出最终优化的基础配方
pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究
pH控制摇床在1, 3-丙二醇发酵中的应用
1,3-丙二醇的用途：
可作为增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂等 用于食品、化妆品和制药等工业
最重要的用途是作为单体与对苯二甲酸丙二 醇聚合生产聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)
① 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应
工业上常用淀粉水解糖，但是糖液必须达到一定的 质量指标
不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大
② 糖蜜
糖蜜：是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。
主要成分：含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘 蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。
考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 进一步：乙酸钠的浓度2%比较好
结果：
碳源：乙酸钠 0.2% 氮源：氯化铵 0.2%, 酵母膏 0.03% 无机盐: 复合无机盐 0.05%
正交设计确定优化的配方 ( L9（34）)
改进后培养基 原培养基
改进后培养基的发酵结果
四 摇瓶水平到反应器水平的优化配方
发酵培养基的作用：
满足菌体的生长 促进产物的形成
发酵培养基的要求
① 满足产物最经济的合成。 ② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 ③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳 定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏， 能保证生产上的供应。 ④ 应能满足总体工艺的要求，如不影响通气、提取、 纯化及废物处理等。
目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断 和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物 化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照 前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结 合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小 型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择 出较为适合的培养基。
一、培养基成分选择的原则
第一节 培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型
一、按纯度
合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律
培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模 工业生产 天然培养基: 采用天然原料 原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适 于工业化生产 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性