发酵——PH

★微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因： •由于有机物分解： 分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降； 分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升 •由于无机盐选择性吸收： NH4+被吸收 铵盐吸收（(NH4)2SO4 H2SO4）， pH↓ NO3+被吸收 硝酸盐吸收(NaNO3 NaOH)， pH↑
乳酸杆菌醋酸杆菌1212不同微生物对不同微生物对phph要求不同要求不同微生物种类微生物种类最低最低phph最适最适phph最高最高phph大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌黑曲霉黑曲霉一般放线菌一般放线菌一般酵母菌一般酵母菌434345454242151550503030606080806060757570707575505060607070808050506060959585859393909010108080一些微生物生长的ph值范围微生物ph值最低最适最高thiobacillusthiooxidans氧化硫硫杆菌05203560lactobacillusacidophilus嗜酸乳杆菌4046586668rhizobiumjaponicum大豆根瘤菌426870110azotobacterchroococcum圆褐固氮45747690nitrosomonassp
微生物 灰色链霉菌 红霉素链霉菌 产黄青霉 金霉素链霉菌 龟裂链霉菌 灰黄青霉
生长最适pH 6.3~6.9 6.6~7.0 6.5~7.2 6.1~6.6 6.0~6.6 6.4~7.0
合成抗生素最适pH 6.7~7.3 6.8~7.3 6.2~6.8 5.9~6.3 5.8~6.1 6.2~6.5
在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行 补料。在补料与调 pH 没有矛盾时采用 补料调pH 如（ 1 ）调节补糖速率，调节空气流量 来调节pH (2)当NH2-N低，pH低时补氨水； 当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱 调pH
天冬酰胺酶
5、不同调pH方法的影响
生长的最适pH值与发酵的最适pH值
同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中， 对pH值的要求也不同。
举例：Aspergillus niger在pH2~2.5范围时有利于合成柠檬酸，当在 pH2.5~6.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸 为主。 丙酮丁醇梭菌在pH5.5~7.0范围时，以菌体生长为主，而 在pH4.3~5.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。
6、发酵的不同阶段采取不同的pH值
例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）
菌株最适生长pH控制在6.8～7.0
不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7．5 时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于6．5时 菌体同样受抑制，易于老化。而在7．2左右时，菌 体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6．9左右时， 菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优 势。
pH6．9时，菌体生长旺盛，pH7．15时，对菌体的 产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用 阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制 pH6.9，到48h后pH值为7．15，到80h后pH值为 7．25。产率22．27g· /L，产酸率提高12．23％。
例：克拉维酸发酵中pH变换控制 问题的提出：在pH低时菌体生长受 抑制，在高pH时克拉维酸要分解 用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现， 前期由于微生物产生的酸性副产物和 有机酸使pH降至6.5。在达到最高细胞 浓度后，pH开始从6.5升至8.3。CA产 量达最高水平时，pH不再升高。在发 酵终止时，pH再次升至8.5。随着pH升 高，CA迅速分解。
3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响
X
生长 合 成
四 环 素
pH pH对菌体生长影响比产物合成影响小 例 青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适 pH7.2~7.4 四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适 pH5.8~6.0
4、最佳pH的确定
配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况
不同微生物的生长pH值范围
微生物 pH值 最低 最适 Thiobacillus thiooxidans 氧化硫硫杆菌 0.5 2.0~3.5 Lactobacillus acidophilus 嗜酸乳杆菌 4.0~4.6 5.8~6.6 Rhizobium japonicum 大豆根瘤菌 4.2 6.8~7.0 Azotobacter chroococcum 圆褐固氮 4.5 7.4~7.6 Nitrosomonas sp. 硝化单胞菌 7.0 7.8~8.6 Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 4.0~4.5 5.4~6.3 Staphylococcus aureus 金黄葡球菌 4.2 7.0~7.5 Chlorobium limicola 泥生绿菌 6.0 6.8 Thurmus aquaticus 水生栖热菌 6.0 7.5~7.8 Aspergillus niger 黑曲霉 1.5 5.0~6.0 一般放线菌 5.0 7.0~8.0 一般酵母菌 3.0 5.0~6.0 最高 6.0 6.8 11.0 9.0 9.4 7.0~8.0 9.3 7.0 9.5 9.0 10.0 8.0
1.3微生物细胞内的pH值 •微生物细胞内的pH值相当稳定，一般都接 近中性。 •这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够 保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和 细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶 的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值 接近环境pH值。
1.4 微生物的生命活动对环境pH值的影响
一些微生物生长的pH值范围
微生物种类 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 黑曲霉 一般放线菌 一般酵母菌 最低pH 4.3 4.5 4.2 1.5 5.0 3.0 最适pH 6.0—8.0 6.0—7.5 7.0—7.5 5.0—6.0 7.0—8.0 5.0—6.0 最高pH 9.5 8.5 9.3 9.0 10 8.0
1.2 不同微生物对pH要求不同
微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低 于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或 导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长 的最适pH值，将微生物分为：
嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌
总结 pH控制是一项非常细致的工作，不仅 考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段 考察对pH的要求。在pH控制中还要采 用合适的调节方法。
小
发酵过程pH会发生变化
结
变 化 原 因
基质代谢 产物形成 菌体自溶
对 发 酵 的 影 响
pH
pH影响酶的活性
pH值影响微生物细胞膜所带电荷的 改变
pH值影响培养基某些成分和中间代 谢物的解离 pH影响代谢方向
二、pH对发酵的影响
1、实例 例 pH对林可霉素发酵的影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发 酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及 时补糖、 (NH4)2SO4 或酸，发酵液 pH 可迅速升到 8.0 以上， 阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。 对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小 时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。 发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3， 调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵 单位。
★配制培养基时调整pH值的措施： ★培养过程中调节pH值的措施
过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。
过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。
影响环境PH值的其他因素还包括
1、产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵 液pH变化。如有机酸类产生使pH下降， 红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素 呈碱性，使pH上升。 2、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH 上升。
研究不同pH对发酵的影响 分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基测 定菌的生长和产物合成
pH6.0时，生长受 抑制，产物降解 少
pH7.0时的状况
pH8.0时生长良好
产量低，产物降 解
控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓度接近相同(约 16％PMV)，但控制pH6．0时细胞生长受抑制。
在2．5升生物反应器内，
pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响
基础培养基调节pH
（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物 的解离，从而影响微生物对这物质的利用
（4）pH影响代谢方向 pH 不同，往往引起菌体代谢过程不同， 使代谢产物的质量和比例发生改变。例 如黑曲霉在 pH2~3时发酵产生柠檬酸， 在pH近中性时，则产生草酸。
谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积 累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷 氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺
分别在4种缓冲介质中， 于pH 6．50一9．50测定天 冬酰胺酶酶活力． 1 甘氨酸介质pH 8.00时 酶活力最高； 2 硼酸在pH 8．50，酶反 应最快 3 磷酸在pH 8．50，酶反 应最快
4 Tris在pH 8．50，酶反应 最快
酶活1＞2＞4＞3
异亮氨酸发酵
不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮 氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。 “1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示 只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联 合控制pH值。
•同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程 中，对环境pH值要求不同。
例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.5—7.0时，以菌体生长为主 在pH值=4.3—5.3时，进行丙酮丁醇发酵
•同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代 谢产物。 例如：黑曲霉
pH值=2—3时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。 pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。
pH 7.0 pH
效价
t 不调pH 调pH
例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响
pH在4～7范围内产酶最高
2、pH对发酵的影响
（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体 某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻
（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，
从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养 物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈 代谢的进行
第四节
发酵过程的pH控制
pH是微生物代谢的综合反映，又影响代 谢的进行，所以是十分重要的参数。 发酵过程中pH是不断变化的，通过观 察pH变化规律可以了解发酵的正常与 否
一.发酵过程中PH值和微生物生长的相互关系
1. pH值与微生物生长的相互影响
◆影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影 响对物质的吸收能力。 ◆改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如： 酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、 酸。 ◆环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程 度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。
试验两阶段的最适pH，见表
稳定期随着pH降低，糖耗速率增加， 生物量增加，但产物合成速率在 pH5.6时达到最高。说明当pH小于5.6 以后微生物消耗的糖并非用于合成热 凝胶，而是合成菌体。
三、pH的控制 1、调节好基础料的pH。基础料中若含 有玉米浆， pH 呈酸性，必须调节 pH 。 若要控制消后 pH 在 6.0 ，消前 pH 往往要 调到6.5~6.8 2、在基础料中加入维持pH的物质，如 CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷 酸缓冲液等 3、通过补料调节pH
不控制pH时2．47μ g／(m1· h ) 控制pH7.0时的产率3．37μ g／(m1· h) 最高 控制pH8.0时，产率2．02μ g／(m1‘h) 在控制pH6．0时，CA产生被抑制,但降解少
因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0， 但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。
由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各 不相同，因此在分批发酵中应用了pH变换 策略，使发酵pH由中性pH7．0变换为酸性 pH6.0。 在发酵前期，在细胞生长和产生CA期间控 制pH7.0，4d后，当CA产量达最高值时， 变换pH为6.0，以减少CA分解。最高CA浓 度可保持24h。由于改变pH，使CA分解速 率明显降低。
pH对产海藻酸裂解酶的影响
pH对海藻糖水解酶产生的影响
pH——菌浓
pH——酶活
pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响
热凝胶产生不同阶段pH的考察
pH
DO
biomass
从图中可见，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶 合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两 个阶段：前10 h是菌体生长期，之后热凝胶 开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。 在菌体生长期，DO 直线下降，培养液中的 pH也迅速下降。10 h左右，菌体质量浓度达 到最大值，DO 和pH降至最低点（5.4～5.6）， 菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。