犬源A型贾第虫real-time PCR检测方法的建立

犬源A型贾第虫real-time PCR检测方法的建立
张萍;刘远佳;李结;李金平;孟祥龙;郭建超;李国清
【摘要】To establish a detection method for zoonotic Giardia larnblia, a real-time PCR assay based on SYBR Green I was developed with a pair of primers designed according to the 16S Rrna gene of G. Lamblia from dogs and a recombinant plasmid containing the target gene was constructed as
a standard control. Tm value of the amplified product was confirmed to be
94.20 ℃. This technique was highly sensitive with a detection limit of 3.39 copy/Μl of posit ive recombinant plasmid without any cross-reaction with Cryptosporidium, coccidium and Toxoplasma gondii. The correlation coefficient of the standard curve was 0.99, and had a coefficient of variations less than 3% for both intra- and inter-assay. The developed real-time PCR using SYBR Green I was specific, highly sensitive, and could be further used in clinic detection and epidemic investigation of giardiosis.%
为建立贾第虫定性定量的检测方法,本研究针对犬源贾第虫16S rRNA基因片段设
计一对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了贾第虫DNA的SYBR Green
Ⅰ real-time PCR检测方法.结果显示,特异性产物Tm值为94.20℃,最低可检测到3.39 copy/μL的阳性质粒,标准曲线的相关系数为0.99.与其他常见原虫隐孢子虫、球虫、弓形虫均不发生交叉反应,重复性变异系数小于3％.该检测方法具有较好的
特异性和敏感性,为贾第虫病的临床检测和流行病学调查提供了新的技术手段.
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2011(033)012
【总页数】4页(P961-964)
【关键词】贾第虫;实时荧光定量PCR
【作者】张萍;刘远佳;李结;李金平;孟祥龙;郭建超;李国清
【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642
【正文语种】中文
【中图分类】S852.7
蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)是一种多宿主的单细胞真核生物，其滋养体寄生在人或动物的小肠，引起以腹泻为主的贾第虫病[1]。

通过分子生物学方法可以将蓝氏贾第虫至少分为7个(A～G)有效集聚体，其中只有A和B型是人兽共患的基因型，可以感染人、犬、猫、家畜和其他野生动物，而其他的集聚体(C-G)则宿主范围较窄[2]。

由于贾第虫病的临床症状类似于一般的肠炎、细菌性痢疾、消化不良等，易误诊误治，造成病程由急性转为慢性[3]。

因此开展该病原的检测，对其防治有重要意义。

目前，贾第虫的实验室检测方法包括形态学检查、免疫学检测和普通PCR检测等[4]。

但这些方法在特异性、敏感性和时效性等方面均存在不足。

而实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术能够快速、准确、灵敏地对病原DNA进行定量，同时可以动态地研究整个病程中病原数量与疾病进展的关系，从而能够进行疾病的早期诊断、药物疗效观察、病情判断和预后等[5-6]。

因此，本实验建立了贾第虫
realtime PCR检测方法，为人畜共患的贾第虫的快速诊断和定量检测提供技术手段。

1 材料和方法
1.1 虫株来源 A型贾第虫标准阳性DNA为本实验室分离鉴定并保存[7]；含犬源
贾第虫卵囊的粪便采集自广州市某流浪犬收容所；隐孢子虫为上海兽医研究所馈赠，球虫及弓形虫为本实验室保存。

1.2 主要试剂粪样DNA提取试剂盒及胶回收试剂盒购自OMEGA公司；SYBR GreenⅠ染料、小量质粒回收试剂盒、ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体试剂盒、PCR试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试
剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.3 病原的分离纯化取新鲜粪便加入10倍体积水混匀过滤，3 000 r/min 10 min，弃上清，收集沉淀加入等体积33%硫酸锌溶液充分搅匀，2 500 r/min 10 min，取上清加4倍体积水混匀，3 000 r/min 10 min，弃上清，加入10 mL蒸
馏水，4℃保存备用。

1.4 犬源贾第虫基因组DNA的提取按OMEGA粪样DNA提取试剂盒的说明，
从纯化后的包囊中提取DNA，4℃或-20℃保存备用。

1.5 引物的设计与合成根据GenBank中登录的A型贾第虫16S rRNA序列
(AF199443)，用Primer 5.0软件设计一对特异性引物，16S1(5'-TGCTAGCC GGACACCGCTGG-3')；和16S2(5'-GGTGATGCCCC GGAAGCCCG-3')，预计扩增片段大小为113 bp，引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

1.6 标准阳性样品及分离株的普通PCR 反应体系为25μL，PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃30 s、62℃30 s、72℃45 s，36个循环；72℃ 7 min。

将PCR扩
增产物纯化，连接转化后由上海英潍捷基贸易有限公司测序，进一步确定分离株基因型。

1.7 阳性质粒标准品的制备将PCR扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体中，转化DH5α感受态细胞，将PCR鉴定为阳性的重组质粒作为标准品，用于real-time PCR扩增。

1.8 Real-time PCR的建立反应体系为20 μL，反应条件为：95℃ 2 min；94℃20 s、62℃ 15 s、72℃20 s；79℃4 s。

72℃时收集荧光信号，41个循环，每个循环升高0.5℃，停留5 s，绘制融解曲线。

1.9 标准曲线的制作
1.9.1 Real-time PCR扩增将标准品质粒DNA依次做1∶105～1∶109稀释后进行 real-time PCR，制作标准曲线，反应条件同上。

1.9.2 标准品拷贝数的计算测定重组质粒DNA浓度为4.2 ng/μL，将重组质粒DNA以10倍倍比稀释后进行浓度测定，确认稀释后标准品的浓度基本符合倍比关系，证明标准品稀释的准确性，进而得到1 μL标准品的拷贝数为：[4.2×10-
3/(2 692+113)×330×2]×6.02×1023=3.39×1010copy/μL。

1.10 Real-time PCR检测的敏感性试验将质粒标准品做1∶104～1∶109倍倍比稀释后进行 real-time PCR；1∶10～1∶107倍比稀释后进行普通 PCR，比较两种检测方法的灵敏度。

1.11 特异性试验将隐孢子虫、弓形虫和球虫分别作为模板，与阳性标准品及阴性对照用建立的real-time PCR进行检测。

1.12 重复性试验将质粒标准品做1∶104～1∶109倍倍比稀释，用建立的real-time PCR方法分别进行3次批间和批内重复试验。

批间重复性试验：取6个10倍倍比梯度稀释的标准品在相同反应条件下进行3次独立的real-time PCR检测，批间重复分别间隔1周进行。

批内重复性试验：取6个10倍倍比稀释的标准品，每个梯度做3个重复，同时进行real-time PCR检测，根据检测结果计算CT平均值和变异系数(CV)，评价该方
法的稳定性。

1.13 犬源贾第虫分离株的检测分别以制备的阳性标准品和分离株提取的DNA为模板进行real-time PCR扩增，观察比较所形成的扩增曲线和熔解曲线，反应条
件和反应体系同1.8。

2 结果
2.1 普通PCR扩增结果采用16S1和16S2引物进行PCR扩增，电泳结果显示，分离株经PCR扩增得到一条约110 bp的条带(图1)，与贾第虫标准阳性对照株相符。

将分离株的测序结果进行比对分析，结果显示分离株的16S rRNA基因序列
与AF19446的同源性为100%，即该分离株为A型贾第虫。

2.2 标准曲线的建立选用1∶105～1∶109系列倍比稀释的标准重组质粒进行
real-time PCR扩增，用Rotor Gene Q软件进行数据分析，以起始拷贝数的稀释倍数为X轴，以CT值为Y轴，建立标准曲线(图2)。

模板CT值与该模板起始拷
贝数存在线性关系，起始拷贝数越大，CT值越小。

该直线斜率为-3.5015，截距
为28，相关系数r=0.99806，PCR扩增效率为93%，从而得出标准曲线：Y=-3.5015X+28。

2.3 Real-time PCR的敏感性分析将阳性质粒标准品以1∶104～1∶109系列倍
比稀释后作为模板，按优化的反应条件进行real-time PCR。

从熔解曲线(图3)可
以看出，阳性标准品109稀释可作为检测的底线，即可检测的最低限量为3.39 copy/μL，其特异性产物Tm值均为94.20℃，而模板109稀释的CT值为29.89，模板扩增的CT值在15～30时，扩增效果良好。

CT值在32以上视为模板扩增后的荧光强度没有达到阈值，而且其熔解曲线也出现了非特异性扩增，与阴性对照的Tm值一致(83.75℃)。

本试验建立的real-time PCR的检测灵敏度为模板的1010
稀释，而普通PCR检测灵敏度为107(图4)，该real-time PCR检测灵敏度比普
通PCR高1 000倍。

2.4 特异性试验将隐孢子虫、弓形虫和球虫DNA分别作为模板，与阳性标准品
及阴性对照同时进行real-time PCR，其扩增曲线显示，只有贾第虫分离株出现特异性扩增，而其他虫株检测结果均为阴性(图5)。

表明该方法检测贾第虫具有良好
的特异性。

2.5 重复性试验将阳性质粒标准品做1∶104～1∶109倍倍比稀释，分别进行3
次批间和批内重复试验。

统计分析结果显示，批内重复性试验的变异系数(CV)为0.2%～1.3%，批间重复性试验的变异系数为0.3%～2.4%，均小于3%(表1)。

表明该方法具有良好的重复性。

表1 SYBR GreenⅠ实时荧光PCR的组内和组间重复性试验结果Table 1 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the SYBR Green I real-time PCR 104 105 106 107 108 109 333333 13.34±0.03 17.33±0.22 21.19±0.20 24.11±0.07 27.66±0.20 30.08±0.09 0.2 1.3 0.9 0.3 0.7 0.3 13.38±0.31
17.37±0.24 20.52±0.35 23.85±0.57 27.52±0.36 30.06±0.10 2.3 1.4 1.7 2.4 1.3 0.3
2.6 分离株的real-time PCR检测试验结果显示，分离株和阳性对照都产生了“S”形的扩增曲线。

从熔解曲线上可以看出，两者都具有相同的Tm值
(94.20℃±0.2℃)(图6)。

而阴性对照的Tm值为83.75℃，且背景信号强度很低，与阳性对照对比明显，表明该引物的特异性很好。

3 讨论
Real-time PCR方法是一种定性定量的检测方法，常用的有两种，即SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法。

SYBR GreenⅠ法成本低，操作简便，虽然其特异性不如TaqMan探针法，但配合特异性高的引物，并通过对熔解曲线的分析，也可以达到很高的特异性。

本研究中real-time PCR熔解曲线的结果显示，该引物
的特异性良好，在检测温度内不产生引物二聚体和非特异性扩增。

关于real-time PCR检测贾第虫在国外已有一些报道[8-11]，然而，国内尚未见应用该技术检测贾第虫的报道。

本研究根据A型贾第虫(即人畜共患的贾第虫)16S rRNA基因设计并合成1对引物，构建质粒标准品，建立的标准曲线的相关系数
r=0.99，线性良好；扩增效率E=0.93，介于0.9和1.2理想值之间，扩增效率良好。

该方法的检测下限达到3.39 copy/μL。

产物的熔解曲线只有唯一的特异性熔解峰，琼脂糖凝胶电泳只出现唯一的特异性条带。

实验结果表明，该荧光定量PCR技术具有很高的敏感性和特异性，在实验室检测贾第虫快速而准确，可用于
大批量的粪样检测。

该检测方法的建立为贾第虫病的临床检测和流行病学调查提供了一种新的技术手段。

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