猴痘病毒的PCR快速检测试剂盒及检测方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101407850A [43]公开日2009年4月15日
[21]申请号200810234009.3[22]申请日2008.11.20
[21]申请号200810234009.3
[71]申请人江苏出入境检验检疫局动植物与食
品检测中心
地址210001江苏省南京市中华路99号
[72]发明人陈国强 张敬友 蒋原 张常印 姜焱 唐
泰山 朱娜 范红结 [74]专利代理机构南京众联专利代理有限公司代理人王荷英
[51]Int.CI.C12Q 1/70 (2006.01)C12Q 1/68 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页
[54]发明名称
猴痘病毒的PCR快速检测试剂盒及检测方法
[57]摘要
本发明涉及一种猴痘病毒的PCR快速检测试剂
盒及其检测方法，包括试剂A、B、PCR试剂管、Taq
DNA聚合酶、含有猴痘病毒特异的F3L基因片断的pU
C57质粒的阳性对照和灭菌的双蒸水阴性对照组成
的试剂盒。

采用简单快速敏感的PCR检测试剂盒，
根据猴痘病毒所特有的一段保守序列设计特异引物
并进行扩增比较，在3－4小时即可得知猴痘病毒检
测结果，灵敏度较高，检测下限低至0.3pg的DNA浓
度，确保了检测的准确性与特异性。

特别适用于出
入境检验检疫中，对来自美国和非洲的实验鼠等饲
养啮齿动物以及猴等灵长类动物、家兔及其产品中
猴痘病毒进行高灵敏快速检测。

200810234009.3权 利 要 求 书第1/2页 1.猴痘病毒的PCR快速检测试剂盒，其特征是包括：
(1)DNA提取试剂：含试剂A、B，其中：
试剂A含有
异硫氰酸胍，浓度5M；
三羟基甲基氨基甲烷，浓度0.05M；
乙二胺四乙酸，浓度0.02M；
聚乙二醇辛基苯基醚体积浓度1.3％；
试剂B为苯酚、氯仿和异戊醇混合物，三者体积比是25∶24∶1；
(2)PCR试剂管成分为：
10×buffer：2-4μL，
d N T P：0.2-0.8μL，包含d A T P、d T T P、d C T P和d G T P，每种浓度为2.5m M； MgCl2：0.2-1μL，浓度2.5mM；
引物对1、2，各0.2-2μL，浓度各为10μM；
灭菌去离子水：8.7-16.1μL；
(3)Taq DNA聚合酶：0.1-0.5μL，浓度5U/μL；
(4)阳性对照：即含有猴痘病毒特异的F3L基因片断的p U C57质粒；
(5)阴性对照：已灭菌的双蒸水；
所说的引物对1和2是DNA片段，碱基序列分别为：
5’T T C C G T C A A T G T C T A C A C A G G C A 3’、5’T A C A G T T C C G A C G A T A C T C C T C C 3’。

2.根据权利要求1所述的猴痘病毒的P C R快速检测试剂盒，其特征是所说的PCR试剂管成分为：
10×buffer：2μL；
d N T P：0.4μL，包含d A T P、d T T P、d C T P和d G T P，每种浓度为2.5m M； MgCl2：0.4μL，浓度2.5mM；
引物对1和2：各0.4μL，浓度10μM；
灭菌去离子水：15.2μL；
所说的Taq DNA聚合酶：0.2μL，浓度5U/μL。

200810234009.3权 利 要 求 书 第2/2页 3.一种采用权利要求1的PCR试剂盒检测猴痘病毒的的方法，其特征是如下步骤： (1)样品处理：取实验动物的咽喉拭子样品，用200μL灭菌去离子水充分洗涤拭子样品得到含有病毒的悬液；
(2)DNA提取：加入400μL的试剂A，600μL的试剂B并充分混匀，4℃，12000rpm 离心3-5min，取上清液加入600μL氯仿混匀，12000rpm离心5min后取上清，加入0.8倍的异丙醇，混匀并10000rpm离心10min弃去上清，加入70％重量浓度的乙醇溶液洗涤，离心3-5min，晾干后加入50μL灭菌双蒸水溶解得DNA提取液；
(3)PCR扩增
在PCR试剂管内加入0.5-1μL的DNA提取液，0.2-1μL5U/μLTaq DNA聚合酶，瞬时离心混匀，置PCR仪进行扩增；95℃预变性5 min后，95℃变性1min，51℃复性1min，72℃延伸1min，如此进行35个循环；最后72℃延伸10min，同时设立阳性和阴性对照；
(4)PCR扩增产物分析
取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0.5-1μg/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，阳性孔有301 bpDNA 条带而阴性孔无的情况下，如果样品孔有301 bpDNA条带，则样品中含有猴痘病毒，反之则没有猴痘病毒。

200810234009.3说 明 书第1/6页
猴痘病毒的PCR快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及猴痘的PCR检测试剂盒及其检测方法，属于生物领域。

主要用于对来自美国和非洲的实验鼠等饲养啮齿动物以及猴等灵长类动物、家兔及其产品中猴痘病毒进行高灵敏快速检测。

背景技术
早在1958年，人们就发现一种痘病毒在实验猕猴中可引致一种类似于人天花的疾病，这种病被称为猴痘，该病毒也因此而得名猴痘病毒。

1970年首次报导扎伊尔地区出现人的猴痘病例，主要特征表现为类似于天花的水疱和脓疱疹，但猴痘病毒的传染性和致病力要比天花病毒弱。

此后，非洲中西部雨林国家利比里亚、喀麦隆、象牙海岸、塞拉里昂、刚果等国都曾报告有疫情发生，但还仅限于在非洲地区，当时尚未引起人们的关注。

猴痘病毒的储存宿主并不仅是猴类，许多啮齿动物如草原土拨鼠、冈比亚硕鼠、松林鼠、条纹松鼠、兔等均可为其储存宿主。

2003年5-6月，美国因草原犬鼠等野生啮齿动物传染引发人的猴痘疫情，共报告了81例，遍及美国7个州，因而引起人们极大关注。

我国质检总局和农业部于2003年7月联合发布公告，对来自美国和非洲的实验鼠等饲养啮齿动物以及猴等灵长类动物、家兔及其产品须进行猴痘检疫。

因此，开展猴痘的检疫方法的研究，为防止猴痘传入我国，保护我国畜牧业安全和人体健康，具有重要的意义。

经检索，国外报道受权威部门认可的的实验室诊断猴痘感染的方法分为三大类，第一类是病原分离的方法，通过细胞培养，分离出猴痘病毒；第二类是基因诊段的方法，采用PCR方法检测到标本中的猴痘病毒核酸；第三类是电镜检查，发现受检物中有与正痘病毒形态一致的病毒存在。

就上述三类诊断猴痘感染的发方法而言，各有利弊：病毒分离，结果准确，但检测周期太长，至少需要两个星期，用于出入境检验检疫不太现实，而且由于进行活毒操作，对实验室生物安全要求极高；电镜检查的方法，灵敏度不高，样品准备复杂，周期长，更致命的缺陷是的是需要电镜，电镜极其昂贵，操作极其复杂。

综上，开展猴痘PCR诊断方法的研究符合检验检疫部门的实际情况，能够满足检验检疫部门的工作需要。

近年来人们对运用P C R方法对猴痘病毒进行检测方面也做了很多的研究，如Ropp，Lbrahim等则利用血凝素基因序列扩增并对扩增片段进行限制性酶切分析以检测猴痘病毒，但其实验中需要酶切，结果不够直观且耗时长。

周为名，Kulesh等则利用荧光定量实时PCR方法对猴痘病毒进行了检测，虽然与常规PCR方法相比，荧光定量PCR方法因为不需要电泳分析，同时因加入特异的荧光标记探针可对PCR扩增产物进行实时检测，因而更省时、特异，减少了交叉污染，并能精确地对多个样本定量分析，但其也存在很明显的缺点，如需要荧光PCR仪，对实验室的设备要求较高，且成本也比较高，此外，荧光定量PCR方法对引物及探针的设计要求也很高，综上，虽荧光定量PCR方法现得到了较快的发展，但其仍不如常规PCR方法普遍与方便，本发明就是在常规PCR方法的基础上研制的能快速、高灵敏地检测猴痘病毒的试剂盒及检测方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种猴痘病毒的P C R快速检测试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案如下：
猴痘病毒的PCR快速检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中猴痘病毒的方法，以实现对猴痘病毒的快速、准确地检测。

其中所述快速检测猴痘病毒的PCR试剂盒，包括：
1.猴痘病毒的PCR快速检测试剂盒，其特征是包括：
(1)DNA提取试剂：含试剂A、B，其中：
试剂A含有
异硫氰酸胍(GuSCN)，浓度5M；
三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，浓度0.05M；
乙二胺四乙酸(EDTA)，浓度0.02M；
聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)体积浓度1.3％；
试剂B为苯酚、氯仿和异戊醇混合物，三者体积比是25∶24∶1；
(2)PCR试剂管成分为：
10×buffer(即10倍浓度的缓冲溶液)：2-4μL，
d N T P：0.2-0.8μL，包含d A T P、d T T P、d C T P和d G T P，每种浓度为2.5m M； MgCl2：0.2-1μL，浓度2.5mM；
引物对1、2，各0.2-2μL，浓度各为10μM；
灭菌去离子水：8.7-16.1μL；
(3)Taq DNA聚合酶：0.1-0.5μL，浓度5U/μL；
(4)阳性对照：即含有猴痘病毒特异的F3L基因片断的p U C57质粒；
(5)阴性对照：已灭菌的双蒸水；
所说的引物对1和2是DNA片段，碱基序列分别为：
5’T T C C G T C A A T G T C T A C A C A G G C A 3’、5’T A C A G T T C C G A C G A T A C T C C T C C 3’。

所说的PCR试剂的最佳成分为：
10×buffer：2μL；
d N T P：0.4μL，包含d A T P、d T T P、d C T P和d G T P，每种浓度为2.5m M； MgCl2：0.4μL，浓度2.5mM；
引物对1和2：各0.4μL，浓度10μM；
灭菌去离子水：15.2μL。

所说的Taq DNA聚合酶：0.2μL，浓度5U/μL。

采用PCR试剂盒快速检测猴痘病毒的的方法，如下步骤：
(1)样品处理：取实验动物的咽喉拭子样品，用200μL灭菌去离子水充分洗涤拭子样品得到含有病毒的悬液；
(2)DNA提取：加入400μL的试剂A，600μL的试剂B并充分混匀，4℃，12000rpm 离心3-5min，取上清液，加入600μL氯仿，混匀，12000rpm离心5min后取上清加入0.8倍的异丙醇，混匀并10000rpm离心10min，弃去上清，加入70％乙醇溶液洗涤，离心3-5min，晾干后，加入50μL灭菌双蒸水溶解，得DNA提取液；
(3)PCR扩增
在PCR试剂管内加入0.5-1μL的DNA提取液，0.2-1μL5U/μL Taq DNA聚合酶，瞬时离心混匀，置P C R仪进行扩增；95℃预变性5m i n后，95℃变性1m i n，51℃复性1m i n，72℃延伸1m i n，如此进行35个循环；最后72℃延伸10m i n，同时设立阳性和阴性对照；
(4)PCR扩增产物分析
取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0.5-1μg/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，如果阳性孔有301bpDNA
条带而阴性孔无的情况下，样品孔有301bpDNA条带，说明样品中含有猴痘病毒，反之则没有猴痘病毒。

本发明的主要原理为：试剂A和B将样品中病毒DNA进行抽提。

PCR试剂管含多聚酶链式反应试剂，通过加入猴痘病毒特异DNA片段引物和Taq DNA聚合酶等成分，对样品中所提取出的DNA进行特异性的扩增。

由于所设计的引物是猴痘病毒所特有，因此，若样品中含有猴痘病毒，那么其DNA经过扩增及电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以检测到一定分子量的条带，如果样品中没有猴痘病毒也就不能出现同样分子量的条带 本发明具有如下优点：
本发明在设计猴痘病毒特异引物并成功建立猴痘病毒的PCR检测方法的基础上，进一步研制成简单快速敏感的PCR检测试剂盒，与其它的猴痘病毒检测技术相比，本发明方法的显著的特点是：1)检测快速，3-4小时即可得知检测结果，而其它的方法如病毒分离技术至少需要24小时或一个星期以上；特别适合出入境检验检疫检验工作需要；2)检测的灵敏度较高，检测下限低至0.3pg的DNA浓度；3)本发明根据猴痘病毒所特有的一段保守序列设计特异引物并进行扩增比较，确保了检测的准确性与特异性。

附图说明
图1是用本试剂盒对南京红山动物园猴子样品猴痘病毒P C R检测的电泳图，其中12孔为阴性孔，13孔为阳性孔，其余为样品孔。

图2是用本试剂盒对苏州某实验动物中心猴子样品猴痘病毒PCR的电泳图，其中1孔为阴性孔，2孔为阳性孔，其余为样品孔。

具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明：
实施例1
对南京红山动物园的猴子进行咽喉拭子采样并用本发明进行检测实验。

按以下配方制作快速检测猴痘病毒的试剂盒
(1)DNA提取试剂：含试剂A、B
试剂A：含有异硫氰酸胍(GuSCN)，三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。

它们的浓度分别是5M、0.05M、0.02M，1.3％(体积百分数)。

试剂B：由苯酚、氯仿和异戊醇按一定比例混合而成，它们的体积比是25∶24∶1。

(2)PCR试剂管成分为：2μL10×buffer，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，0.4μL
dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度为2.5mM)，2.5mM 0.4μL MgCl2，引物对1和2为10μM 0.4μL，15.2μL灭菌去离子水。

(3)Taq DNA聚合酶0.2μL，5U/μL。

(4)阳性对照，即含有猴痘病毒特异的F3L基因片断的pUC57质粒
(5)阴性对照，即已灭菌的双蒸水。

按照以下程序进行检测：
(1)样品处理：取实验动物的咽喉拭子样品，用200μL灭菌去离子水充分洗涤拭子样品得到含有病毒的悬液
(2)DNA提取：加入400μL的试剂A，600μL的试剂B并充分混匀，4℃12000rpm 离心3-5min，取上清液加入600μL氯仿混匀12000rpm离心5min后取上清加入0.8倍的异丙醇混匀并10000rpm离心10min弃去上清，加入70％乙醇洗涤，离心3-5min，晾干后加入50μL灭菌双蒸水溶解沉淀。

(3)PCR扩增
在一PCR试剂管内加入0.5-1μL的DNA提取液，0.2-1μL5U/μL Taq DNA聚合酶，瞬时离心混匀，置P C R仪进行扩增；95℃预变性5m i n后，95℃变性1m i n，51℃复性1m i n，72℃延伸1m i n，如此进行35个循环；最后72℃延伸10m i n，同时设立阳性和阴性对照。

(4)PCR扩增产物分析
取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0.5-1μg/m L的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察结果如图1。

从图1可见：阳性孔有301b p D N A条带，阴性孔无，样品孔未见301b p D N A条带，说明样品中没有猴痘病毒。

检测结果：在红山动物园所取样品中未检测出猴痘病毒。

实施例2
对苏州某实验动物中心动物进行咽喉拭子采样并用本发明进行检测实验。

按以下配方制作快速检测猴痘病毒的试剂盒
(1)DNA提取试剂：含试剂A、B
试剂A：含有异硫氰酸胍(GuSCN)，三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸(EDTA)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。

它们的浓度分别是5M、0.05M、0.02M，1.3％(体积百分数)。

试剂B：由苯酚、氯仿和异戊醇按一定比例混合而成，它们的体积比是25∶24∶1。

(2)PCR试剂管成分为：2μL10×buffer，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，0.4μL dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度为2.5mM)，2.5mM 0.4μL MgCl2，引物对1和2为10μM 0.4μL，15.2μL灭菌去离子水。

(3)Taq DNA聚合酶0.2μL，5U/μL。

(4)阳性对照，即含有猴痘病毒特异的F3L基因片断的pUC57质粒
(5)阴性对照，即已灭菌的双蒸水。

按照以下程序进行检测：
(1)样品处理：取实验动物的咽喉拭子样品，用200μL灭菌去离子水充分洗涤拭子样品得到含有病毒的悬液
(2)DNA提取：加入400μL的试剂A，600μL的试剂B并充分混匀，4℃12000rpm 离心3-5min，取上清液加入600μL氯仿混匀12000rpm离心5min后取上清加入0.8倍的异丙醇混匀并10000rpm离心10min弃去上清，加入70％乙醇洗涤，离心3-5min，晾干后加入50μL灭菌双蒸水溶解沉淀。

(3)PCR扩增
在一PCR试剂管内加入0.5-1μL的DNA提取液，0.2-1μL5U/μL Taq DNA聚合酶，瞬时离心混匀，置P C R仪进行扩增；95℃预变性5m i n后，95℃变性1m i n，51℃复性1m i n，72℃延伸1m i n，如此进行35个循环；最后72℃延伸10m i n，同时设立阳性和阴性对照。

(4)PCR扩增产物分析
取5-10μL扩增后的样品，采用1.2-1.5％的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0.5-1μg/m L的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察结果如图2。

从图2可见，阳性孔有301b p D N A条带，阴性孔无，样品孔有301b p D N A条带，说明样品中含有猴痘病毒。

检测结果：在红山动物园所取样品中未检测出猴痘病毒。

200810234009.3说 明 书 附 图第1/1页
图1
图2。