Sephadex LH-20 层析原理和应用基础

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摘自 Hans Henke 著 Preparative Gel Chromatography on Sephadex LH-20
为了用葡聚糖凝胶分离不溶于盐的水溶液的物质混合物，通过羟丙基化将 Sephadex G 转化 为可在有机溶剂中溶胀的葡聚糖凝胶，因为只有具有孔大小谱的溶胀的凝胶才适于用作凝胶层 析分离用的固定相。将最独特的交联的 Sephadex G-10 转化为 Sephasorb HP,同时通过 G-25 和 G-50 的“烷基化”得到 Sephadex LH-20 和 LH-60。
丙基化葡聚糖凝胶上用纯溶剂进行，即 SephadexLH20 是一个通用的柱填充材料。在 HPLC 中，
无论是在硅胶上，还是在表面改性的硅胶上，每种分离都需要其自己的分离系统，即固定+流动
相。HPLC 几乎总是使用各种梯度的溶剂混合物供选择的分离系统或分离用 。现在我们来考虑
在表 1 中列举的分离机理的特征。
表氯醇的比例越大，交联成分越高。较显著的交联说明溶胀能力小，因此排阻限低。 下面的图表明葡聚糖凝胶的片段，是根据交联和溶胀行为画出的。而且，葡聚糖转化为不 溶于水的凝胶也支持这一“结构式”。从该专利文献可以得到进一步细节。 得到的葡聚糖凝胶溶胀能力取决于葡聚糖的绝对浓度、其平均分子量（MW）和表氯醇的 用量。根据交联度，得到的凝胶的排阻限和分级范围有高有低 1）。溶胀能力用作真实干凝胶的 孔隙率的表征。缓冲水溶液一般用作溶胀剂和洗脱液。
关于 B
分子筛或体积排阻层析（=SEC）是唯一发生在孔体积 Vi 内按分子大小(分子体积)降低的次 序的分离。在间隙体积 V0 内无分离能发生，因为大于凝胶最大孔的所有分子未加分离而被洗脱。
1) W.Winkle,Quantitative Analysis in the V0-Zone,A Quantitative Aprpooach by Coupling HPLC with GPC” in Chromatographia Vol.29.(1990)530.
我们将考虑对于不同溶剂作为流动相测定 V0 和 Vi 的方法，这对实际工作是很重要的。 所用的标准组件是“5 米”柱（内径=25/26 毫米），所用的流动相是甲醇、丙酮、二氯甲烷、 N-甲基吡咯烷酮、醋酸乙酯以及水。使用氯仿和四氢呋喃和其它溶剂主要限于 1 米柱（内径 25 毫米）。 流动相对分离的影响可以在 Sephadex LH20 上用不同的溶剂令人信服地证实。因此，改变 洗脱液1）可以明显提高或改进分离系统的选择性，并可以在很短的凝胶床上进行许多分离。在 29 页的图 6 表示在理想的球形填料中大为简化溶胀凝胶粒子。此图说明间隙和孔体积，其各种 的流动相的实验测定在下面讨论。
图 6 在理想的球形填料中大为简化溶胀凝胶粒子
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3.流动相对分离的影响
3.1 甲醇作为流动相
除水外，甲醇是多年来一直在日常使用的极性最强的流动相。如已叙述的，各种溶剂同 Sephadex LH-20 构成不同的分离系统，这些系统专用于某些类型的化合物。甲醇的一个引人注 目的性质是，由葡聚糖凝胶对芳族和杂环化合物的保留比对来自这种极性和质子溶剂的相应的 脂肪族和脂环族化合物强的多。Sephadex LH-20/甲醇分离系统还有一个特点是选择保留芳族化 合物。苯环上存在的官能团或杂原子是芳族化合物保留的原因。杂原子或官能团的性质、数目 和位置决定了物质的保留行为，而不管它们是脂族的、芳族的或杂环族的。不同的停留时间是 由于氢键的质量和数量的差别，这种氢键是作为溶解在流动相的样品成分和凝胶基体之间的弱 的离子的可逆键。
在含水介质中，Sephadex G-10 显示出最小的溶胀，而 G200 具有最大的水吸收容量。因此， 排阻限由 70 升高到 200 000。这种层析法看似简单，但是，实际上，V0 和 Vi 的精确测定有伴随 的问题。较高分子量的化合物和很小分子被凝胶基体或大或小程度上保留，这取决于溶剂（洗 脱液）的极性。V0 和 Vi 的精确测定对于实际工作者来说是次要的问题，更为重要的是固定条件 以确保分离可比较和可重复。凝胶用量、柱尺寸（内径和长度）以及流动相的流速（毫升/分钟、 毫升/平方厘米和分钟）需要相同。
的概念是在阅读了 HPLC 和 GPC1）结合的文献后本作者得到的。
事实上，从日常实践中我们早已知道，分子筛层析和吸附层析在羟丙基化的葡聚糖凝胶
(hydroxypropylated dextran gel)上用纯溶剂作为流动相是可行的。
Sephadex LH20 结合 HPLC 和 GPC 的分离机理并不难懂。换言之，这两种分离都可以在羟
Sephadex LH-20 的排阻限为 4000，即分子量 4000 或以上的所有化合物在 V0 出现和未被分 离。在各种有机溶剂中，Sephadex LH-20 显示出不同程度的溶胀。这说明，对于较弱的溶胀（较 低的溶剂吸收），排阻限也较低，因为仍然可用的最大的孔比更显著溶胀的情况要小。Sephadex LH-20 的溶胀能力随甲苯、丙酮、二氯甲烷、乙醇、水、二甲基亚砜的次序增加，即其行为在 相同洗出液中和各种 G-型凝胶一样（参见表 2）。
∣→→→V0+ Vi +Vads
∣———————毫升—————————→------
关于 A
在 HPLC 中，分离是在死时间 t0 后开始，因为这是流动相流经填充有固定相的柱部分的整 个长度所需要的时间或洗脱体积，也称为死体积，即间隙体积和孔体积。它只能借助于非保留 物质来测定。换言之，在这一时间之前或这一洗脱体积之前不可能分离。因此，在 HPLC 中， 如果混合物的物质受到不同程度保留（可逆相互作用）,分离只可在硅胶（正相）或在表面改性 的硅胶（RP、CN、NH2 和二元醇相）上进行。
递减次序。吸附-层析分离是更为重要的。毫不夸大地说，与纯溶剂作为流动相的 Sephadex LH20
相比，其它层析分离系统不能显示被分离物质的化学 / 分子结构和其保留行为之间如此多的相
关性。表 1 比较和对比了 HPLC 和 GPC 和 Sephadex LH20 观察到的分离机理。这种制成表对比
关于 C
在分子筛层析（MSC）中主要讨论羟丙基化的葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20，当然这决不是 全部的真实情况。偶尔提到吸附和分配层析可以在这种凝胶上和 G-型凝胶上进行也确是很少。 精确地说，这是低分子量有机化合物（MW<1000）的分离，这些化合物有很多，从而使葡聚糖 如此有价值，因为就分离机理来说，它确实是通用的固定相。正如由许多实例所证实的，可以 有理由地说，用纯溶剂作为流动相的 Sephadex LH-20 代表 A+B 的结合。在该孔体积区只能以分 子大小降低的次序进行分离的说法是不正确的。同样，同凝胶基体的选择相互作用可以使吸附 层析分离成为可能。在 V0+Vi 之后洗脱的那些物质只容易受到吸附效应的事实不需进一步解释。 低分子量有机化合物的吸附主要是由于在溶解的试样成分和溶胀的凝胶基体之间生成不同强度 的氢键和范得华力。
2. 交联的葡聚糖凝胶
2.1 Sephadex LH-20 的生产
Sephadex 葡聚糖凝胶是通过用表氯醇交联多葡聚糖得到的。葡聚糖指的是生长在蔗糖底物 的细菌 Leuconostoc mesenteroides 的代谢产物的线形的高度聚合的碳水化合物的总称。每个葡萄 糖单元含三个羟基，因此，葡聚糖易溶于水。为了得到不溶于水但可以水溶胀的葡聚糖凝胶， 线形多糖链需要同双官能团的表氯醇交联。在溶液中相邻的两个多糖链通过表氯醇交联在碱性 溶液中通过丙三氧基醚桥发生，反应式如下（P. Flodin,PhD Thesis, Uppsala 1962）:
图取自. Pharmacia Biotech company 的刊物：SephasorbTM HP Ultrafine,Chromatography in organic solvents.
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Sephadex LH-20 层析原理和应用基础
1. Sephadex LH-20 同 HPLC 和 GPC 的比较
低分子量（分子量<1000）有机化合物在 Sephadex LH-20 上的分离不完全是按分子大小的
1.4460
0.57
3.8-4.1
61
二氯甲烷
0.42
1.4240
0.44
3.6-3.9
40
四氢呋喃
0.45
1.4070
-
3.3-3.6
67
丙酮
0.56
1.3590
0.32
2.4-2.6
56
醋酸乙酯
0.58
1.3720
0.45
1.6-1.8
77
(10 毫米汞柱)
a)LC 中溶剂的极性标度：来自 L.R.Snyder:“Principle of Adsorption Chromatography”的 Hildebrandt scale.
Sephadex LH-20 可以看作用于凝胶层析的通用的固定相，因为它在水或盐的水溶液中溶胀 行为和在许多有机溶剂（甲醇、乙醇、二氯甲烷和氯仿）中的溶胀行为相同。和前面列举的 Sephadex G 型一样，羟丙基化的凝胶 Sephasorb HP 和 Sephadex LH-20 和 LH-60 的“结构式”可 以图例于图 5。可以很容易地看出，同样数目的羟基，但凝胶的憎水性增加了。这也解释了为 何该凝胶在水中和在高等和中等程度的极性有机溶剂中的溶胀性质相同。SEM 图（图 4）清楚 地表明这种珠状聚合物 Sephadex LH-20。
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出来，从而未分离。同样大小的最小的化合物在 V0 + Vi 最后洗脱也未分离。只有那些大小介于 最大的和最小的化合物的分子以分子量降低的次序洗脱。
表 2：溶剂的性质和物理数据*
M.Dekker .b) 来自 “Sephadex LH-20-Chromatography In Organic Solvents”，但是 NMP 的数据是我们测定的。
c) 大于 0.95。d) 用 1%乙醇。
兰色：葡聚糖 红色：表氯醇 黄色：羟丙基化
图 5.用上述方法可以画出的交联的和羟丙基化的葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20
图 4 Sephadex LH-20 珠状聚合物（放大倍数：270：1）
2.2 间隙体积（V0）和孔体积（Vi）的测定
如果在分子筛层析（MSC）方法后在凝胶上只以分子大小降低的次序分离物质，则只有内 部体积，即孔体积（Vi）可以用于分离，因为所有的大于最大孔的分子同间隙体积（V0）一起
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流动相
极性* （见 a））
折射率 nD20
粘度厘泊 Cp（20℃）
溶胀容量 b12)
(凝胶床的体积)* 毫升/克干凝胶 b)
沸点 ℃
N-甲基-2-吡咯烷酮
-
1.4700
-
5.0-5.3
81
水
高 C）
1.3330
-
4.0-4.4
100
甲醇
0.95
1.3290
0.60
3.9-4.3
65
氯仿 d)
0.40
1
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所有更小分子的其它化合物随着其大小降低进入孔体积 Vi 增加区，并在以后相应地洗脱。按照 反向筛效应的这种层析分离法在洗脱液中最小分子的洗出在最后完成，即 V0 + Vi 之后。对于要 分离的物质来说，在孔谱中存在的流动相部分连同凝胶基体实际是该分离系统的固定相。孔内 试样分子的迁移全由扩散发生。
表1
↓开始
↓死时间 t0
A
HPLC 分离
无分离 ← 柱的总死体积 →
HPLC 分离范围
B
由分子筛层析分离
无分离
排阻区
无分离
(MSC)
按照大小递 减 分离
C
在 A 和 B 后在
无分离
排阻和吸附区
吸附区
Sephadex LH-20
Vads
上分离
C=A+B
↑
↑
↑
开始
V0
(加样)
∣
V0+Vi ∣
∣← V0 → ∣← Vi →