骨质疏松相关的microRNA的分析及其在成骨细胞氧化应激作用中的初步研究

•论著•
骨质疏松相关的microRNA的分析及其在成骨细胞氧化应激作用中的
初步研究*
于森李生娇艾泽馨吴洋欧李家
【摘要】目的：探究与骨质疏松相关的microRNA的生物学作用，并初步验证microRNA在氧化应激状态下在成骨细胞中的作用。

方法：骨质疏松患者的microRNA芯片数据选自GEO数据库，使用GEO2R分析骨质疏松与非骨质疏松之间差异表达的microRNA,miRDB和miRTarBase数据库预测差异microRNA的靶基因并进行GO富集分析和KEGG通路分析，同时建立小鼠骨质疏松动物模型及处于氧化应激状态的成骨细胞，使用qPCR 检测相关microRNA的表达。

结果：从GSE74209数据集中筛选出丨log(foldchange)|>2的microRNA26个，靶基因进行KEGG通路分析发现黏着斑、MAPK通路、激动蛋白骨架调节、趋化因子信号通路等与骨质疏松的发生密切相关，动物模型中检测到miR-491-3p、miR-22-3p、miR-223-3p、miR-32-3p、miR-30c-l-3p、miR-26b-5p表达均降低，氧化应激状态下成骨细胞中检测到miR-30c-l-3p、miR-32-3p表达降低，miR-32-3p与芯片分析结果一致。

结论：miR-32-3p可能通过调节成骨细胞的氧化应激反应，在骨质疏松中发挥重要作用。

关键词：microRNA；骨质疏松；氧化应激；成骨细胞
［中国图书分类号］R782［文献标识码］A DOI:10.19749/.cjgd.1672-2973.2020.04.001
Analysis of osteoporosis-related microRNA preliminary study on oxidative stress in osteoblasts
YU Miao,LI Sheng—jiao,Al Ze—xin,WU Yang—ou,LI Jia.(Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration;Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Hospital of Stomatology,Tongji University, Shanghai200072,ChinaR
［Abstract］Objective:To explore the biological function of microRNA related to osteoporosis,and to verify the role of microRNA in osteoblasts under oxidative stress initially.Methods:MicroRNA microarray data of osteoporosis patients were selected from GEO database,and GEO2R was used to analyze microRNA differentially expressed between osteoporosis and non-osteoporosis.Target genes were predicted by miRDB and miRTarBase,that were imported into DAVID database for GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis.Mice osteoporosis animal model and osteoblast under oxidative stress were established,and qPCR was used to detect the expression of r elevant microRNA.Results:26microRNAs of|log (fold change)|>2were selected from the GSE74209dataset.KEGG pathway analysis of target genes showed that focal adhesion,MAPK signaling pathway,regulation of actin cytoskeleton,chemokine signaling pathway,etc.,were closely
*基金项目：上海市科学技术委员会项目(项目编号：19140904C00,16ZR1439700)
于淼同济大学口腔医学院，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科教研室硕士上海200072
李生娇同济大学口腔医学院，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科教研室副教授上海200072
艾泽馨同济大学口腔医学院，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科教研室硕士上海200072
吴洋欧同济大学口腔医学院，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学附属口腔医院口腔颌面外科教研室硕士上海200072
李家通讯作者同济大学口腔医学院，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学附属口腔医院口腔修复教研室副主任医师上海200072
・193・
related to the occurrence of osteoporosis.MiR-491-3p,miR-22-3p,miR-223-3p,miR-32-3p,miR-30c-l-3p,and miR-26b-5p were all decreased in animal models.MiR-30c-1-3p and miR-32-3p were decreased in the oxidative osteoblasts.MiR-32-3p expression level was consistent with the results of microarray analysis.Conclusions:miR-32-3p may play an important role in osteoporosis by regulating the oxidative stress in osteoblasts.
Key words:microRNA;osteoporosis;oxidative stress;osteoblast
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是最常见的骨骼疾病，由于常伴发骨折，给患者生活带来极大的影响，已然成为重要公共健康问题[I]O由于骨质疏松的发生，骨量的降低及骨结合能力下降，都将影响种植体的初期稳定性，极大影响种植手术预后闵。

近年来，研究发现microRNA在骨代谢中起重要作用，已经逐渐成为骨代谢疾病机制研究的热点之一叫因此，深入探究microRNA与OP的关系，OP发病机制的研究的路。

OP的发病机制尚未完全阐明，既研究
氧化应激(oxidative stress，OS)是引发OP的重要因之一心。

OS是由于生成的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，无法通过内源性抗氧化剂，生，发一的性
，从而进一的过程同。

活性的起骨稳的，骨骨成，OP的发生。

此时成骨[7]，有学者，miR—320a儀
加OS，降低成骨，促进FOP的发生叫Liu呵研究发现，ROS的
骨量，预后起的OP。

在
应激状态下，调节OP的microRNA的研究报道仍,一发现。

本研究将通过GEO(Gene Expression Omnibus)
OP病的，夕
的microRNA，利用miRTarBase和miRDB进行靶基因预测，DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)数据库对靶基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路。

在此基础上，通过构建小鼠骨质疏松动物模型及处于的成骨，对氧化应激条件下OP相关的microRNA进行实验验证。

1.材料和方法
I.I试剂和仪器MC3T3-EI(武汉普诺赛生命科技有限公司，中国)；胎牛血清(biological industrial，以色列)；I%青霉素和链霉素，a-MEM 培养基(HyClone，美国)；强型CCK8试剂盒(北京博奥森生物科技限公司，中国)；TRIzol, PrimeScriptlst StrandcDNA合成试剂盒(TaKaRa，日本)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，美国)；SYBR Green PCR master mix (上海翊圣生物科技有限公司，中国)；基因引物(上海生工生物科技有限公司，中国)；microRNA
物(广州锐博生物科技限公司，中国)；"CT (Scanco50，瑞士)；LightCycler96(Roche，美国)。

I.2microRNA GEO
库(/geo)获取芯片数据集，筛选标准：⑴数据为microRNA；⑵、的骨质疏松非骨质疏松样本；(3)大于5。

基于以上标准，将GSE74209纳入研究。

I.3数据处理与microRNA筛选GEO2R (https:///geo/geo2r/)基于R语言limma包microRNA,利用GEO2R在线分析芯片GSE74209，筛选差异表达的microRNA。

差异表达的microRNA的阈值设置为log(fold change)绝对值大于2，P.adjust 小于0.05。

结果绘制microRNA差！
达量热图。

I.4microRNA的靶基因预测利用miRTar Base(.tw/php/ index.php)和miRDB(/)预测靶基因交集，作为最终靶基因。

I.5基因富集及通路利用DAVID6.7(https:///)网站，输入靶基因，选工具，行GO
KEGG路。

I.6骨质疏松动物模型构建及micro-CT分析采用双侧卵巢切除法(Ovariectomy,OVX)制备骨质疏松物模型，选8周的雌鼠(C57BL/6J)共I0，为OVX SHAM，5，
•194*
注射0・3%的戊巴比妥钠(50mg/kg),固定，消毒，打开腹腔找到卵巢，切除双侧卵巢及其周围的脂肪组织，拉拢缝合并消毒。

SHAM组仅切除卵巢周围脂肪组织。

取小鼠左侧股骨，采用micro-CT进行扫描，在70kV,114m A，体素为14!'的条件下获取股骨图像，并分析生长板下方100层图像，得到骨小梁三维重建图，并进行骨小梁定量分析。

1・7细胞培养及氧化应激处理在"-MEM 培养基中加入10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，MC3T3-E1培养液。

在37?，5%CO2的培养箱中培养，每2〜3d1次培养液，细胞
度达到80〜90%时，1：2〜1：4传代。

使用MC3T3-E1培养液配制过氧化氢梯度处理液，终浓度为100、200、300、400、500、600、700、800!mol/L，每组浓度设置3个复孔。

以3000个细胞/孔的，将MC3T3-E1细胞系接种于96孔板中，细胞过氧化氢处理液处理4h，加入CCK8工作液，2h的光密度值(OD450)，筛选构建氧化应激的。

在氧化应激:中，组为过氧化氢处理组，
组为过氧化氢处理组，组3。

1・8荧光定量PCR提取小鼠股骨骨干部分和过氧化氢处理的细胞的RNA，，使用Trizol裂解方法提取总RNA，使用Prime ScriptlstStrandcDNA试剂盒逆转总RNA，同时使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆转microRNA，得到的cDNA放到-20°C保存。

qPCR Sybr Green Master Mix用于PCR扩,加入各基,选择GAPDH为
基，U6为microRNA，亡置3个复孔，并在LightCycler96上进行qPCR,使用件进行。

基1，microRNA生。

1・98方使用SPSS20.0进行统计学分析，采用！比较两组的，素方分析比较组，"<0・05具有统计学意义。

2.结果
2.1筛选差异表达microRNA通过GEO2R 在线分析，并结合[10]去掉一组离群样本GSM 1914630,分析出26个有表达差异的microRNA，并绘制这26个microRNA量热图，热图显示了microRNAs和样本的双向层次聚类，右侧图例颜色标度显示了microRNA在不同样品中的相对表达水平，见图1。

hsa-miR-4284
hsa-miR-223-3p
hsa-miR-491-3p
hsa-miR-642a-3p
hsa-miR书158>5p
hsa-miR-675-5p
hsa-miR-4534
hsa-miR-30c-1-3p
ebv-miR-BART6-3p
hsa-miR-542-5p
hsa-miR-4687-3p
hsa-miR-642b-3p
hsa-miR-4306
hsa-miR-3202
hsa-miR-5701
hsa-miR-1275
hsa-miR-32013
hsa-miR-423-3p
hsa-miR-4317
hsa-miR-4449
hsa-miR-32-3p
hsa-miR-26b-5p
图l差异microRNA表达量热图hsa-miR-4484
2.2靶基因预测及其功能分析从miRDB数据库中共得到2873个靶基因，miRTarBase数据库共获得4238个靶基，取交集共883个，图2A。

靶基因通路主要富集癌症路、黏着斑、MAPK信号通路、激动蛋白骨架调节、趋化子信号通路等，见图2B。

靶基功能富集分析分为三分，生进程体现在高分子代谢、录调控、磷酸代谢过程、蛋白质氨基酸磷酸化、核昔酸代谢过等；细胞组分体现在细胞器腔及膜，细胞溶
表1用于qPCR基因的引物序列
基因序列5'到3'
GAPDH F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
HO-1F:GAGATAGAGCGCAACAAGCAG R:CTTGACCTCAGGTGTCATCTC
CAT F:CCCCTATTGCCGTTCGATTCT R:TTCAGGTGAGTCTGTGGGTTT
GPX3F:CCTTTTAAGCAGTATGCAGGCA R:3CAAGCCAAATGGCCCAAGTT
NRF2F:3TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT R:3GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC
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质，高尔基体，内质网、核质等；分子功能体现在瞟吟核5酸结合、DNA结合、转录调节活性、ATP结合、转录因子活性、蛋白激酶结合等，见图2C。

.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.1.
■count■-log(Pvalue)
biological process
c
■count B-logCP Value)
cellular component
■c ount■-log(PValue)
molecular function
■c ount■-log(PValue)
A：靶基因测；2基因KEGG通分析；
C基因GO分类和富集分。

图2microRNA的靶基因预测及其功能富集分析
2.3OVX小鼠氧化应激水平检测与SHAM 小鼠相比，OVX小鼠股骨的骨密度(Bone mineral density,BMD)、骨体积分数(Bone volume/total bone volume,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N)显著降低，骨小梁分离度(Trabecular separation,Tb.Sp)显著升高(图3B),提示骨量丢失，表明去卵巢小鼠的骨质疏松动物模型成功建立。

同时，提取小鼠股骨骨干部分总RNA,qPCR 结果表明氧化应激的标志基因血红素加氧酶(heme oxygenase-l,HO-l)、核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2related factor2,Nrf2)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase3,GPx3)均显著上调，如图3C,提示在骨质疏松中氧化应激水平提高。

2.4OVX小鼠中microRNA变化通过miRBase(http://www・mirbase・org/)数据库，对26个差异microRNA逐一比对，挑选在鼠中与人有同源性的microRNA并结合文献，共筛选出6个microRNA,分别为miR-491-3p、miR-22-3p、miR—223—3p、miR-32-3p、miR-30c-1-3p、miR-26b-5p。

与SHAM组相比，OVX组中miR-491-3p miR-22-3p miR-223-3p miR-32-3p miR-30c-1-3p和miR-26b-5p较SHAM组均表达降低，差异，见图4。

2.5MC3T3-E1细胞氧化应激水平检测及microRNA的变化 合的氧化
度，度度分0，100，200，300，400，500，600，700，800!mol/L，CCK8法测定细胞活力。

结果显示(图5A)随着过氧化氢浓度上升，度降，与对相差
!<0・01，且300!mol/L到400!mol/L下降明显，因此300!mol/L作为后续实验浓度。

MC3T3-E1成骨，
体外成骨细胞在氧化应激下microRNA的变化。

过氧化氢处理4h后，HO-1、Nrf2的表达显著升高，见图5B，明在体成骨氧化应激状态。

同时检测6个microRNA的表达，见图5C，miR-30c-1-3p miR-32-3p降，miR-223-3p升，miR-26b-5p、miR-491-3p和miR-22-3p表达无差异。

・196
・
A B
c
u o
s s
a a
x a
<
Z
U
E
e
>
«
®
」
A：小鼠股骨三维重建图；"：股骨骨小梁分析；C：股骨中参与氧化应激的基因CAT、Gpx3、HOI、Nrf2表达水平。

*!<0.05,**!<0.01。

图3OVX小鼠氧化应激水平检测
SHAM组与OVX组股骨中的miR-491-3p<miR-22-3p<miR-223-3p<miR-32-3p<miR-30c-1-3p和
miR-26b-5p的表达水平。

*!<0.05,**!<0.01。

图4OVX小鼠中microRNA变化
・197・
A
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-
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j
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a<N
M
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LOH
B
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uo tt saldxa < N M O 5 l u a> ~e ®」uossaldxa
< N M O
」.2E
a>> J e ®」
A：在100,200,300,400,500,600,700,800#mol/L过，降，且均与不加过氢有统计学差异，！<0.01；@MC3T3-E1中激的基因HO1和Nrf2表达水平；C：MC3T3-E1经300#mol/L过miR-30c-1-3p、miR-32-3p和miR-223-3p的表达水平。

*!<0.05,**!<0.01。

图5MC3T3-E1细胞在过氧化氢处理后氧化应激水平改变及microRNA的变化
3■讨论
近年来，microRNA在骨代谢中发挥了重要作
用，有研究表明miR-214通过靶向ATF4调节骨形成【110,miR-2861表达降低，可降低Runx2蛋白表达，抑制骨形成/120。

我们将通过microRNA芯片分析，挖掘在骨质疏松起调控作用的microRNA。

本研究通过GEO数据库，获取临床骨质疏松患者芯片数据GSE74209,GEO2R分析得到26个差异
microRNA。

经miRDB和miRTarBase数据库预测得到883个靶基因，输入DAVID数据库，进行基因功能的富集分析和通路分析。

KEGG通路主
要富集于癌症通路、黏着斑、MAPK通路、激动蛋骨调节、因通路。

的研究
,通路在骨改建及骨质疏松进程中发挥重要作用⑷。

为了进一步研究差异microRNA在骨质疏松
中的作用，本研究在小鼠体内构建骨质疏松动物模型。

Micro-CT分析结果表明OVX小鼠较SHAM 小骨量丢失明。

qPCR的氧化应激标志基因HO-1、Nrf2{CAT和GPx3,OVX 小鼠较SHAM小鼠均有明显上升。

其中CAT和GPx3为抗氧化酶以清除过多的ROS[13]o HO-1是!一，为蛋白[140o Nrf2可
ARE,激HO-1
除ROS[150。

上述四个基因表达上升，表明在骨质疏松中的了激o我们通过miRBase数据库的microRNA，
26个差异达microRNA的miR-491-3Q、miR-22-3Q、miR-223-3Q、miR-32-3Q、miR-30c—1—3p、miR—26b—5p,PCR检测其表达，与SHAM组比，OVX组表达均表达下降。

本研究结果表明，这6个microRNA可能通过其靶基因参骨质疏松的调o
为进一究6个microRNA在骨质疏松中的作用，我们用过成骨于氧化应激状态。

本研究发现，过氧化氢处理后，成骨细胞内的氧化应激标志基因HO-1和Nrf2表达均升高。

同时，PCR检测了6个差异microRNA 的表达，发现miR-30c-1-3p和miR-32-3p表达降，芯片数据，miR-32-3Q达芯片果一致。

有研究发现，miR-30c-1-3p能通过靶基因调控癌及的增殖及分化血170。

MiR—32—3p通过调控TGF—B信号通路中SMAD2, SMAD4和MAPK1的表达[180,参与慢性鼻窦炎伴鼻息肉的发生。

关于miR—32—3p的骨代谢研究报，我们的研究，miR—32—3Q可能通过
・198
・
调节成骨细胞的氧化应激反应，影响骨质疏松的发生发展，其作用机制仍有待深入研究。

本研究发现，骨质疏松动物模型中miR-491-3p、miR-22-3p和miR-26b-5p表达降低，而在氧化应激状态下的成骨细胞中的表达没有差异。

有文献报道，miR-22-3p通过靶向HDAC6调节人脂肪组织源性间充质干细胞的成骨分化和成脂分化4195,miR-26b-5p通过靶向BMP2调节间充质干细胞的成骨分化[20]o因此，我们推测，miR-22-3p和miR-26b-5p没有通过氧化应激途径调控成骨细胞功能，这两个microRNA可能通过调节骨髓间充质干细胞成骨分化，在骨质疏松发挥作用。

虽然miR-223-3p在OVX小鼠体内表达降低，在氧化应激状态下的成骨细胞中表达，有研究表明miR-223-3p能通过靶向KLF15来防细胞凋亡和氧化应激激4215，关于miR-223-3p在骨质疏松中的作用仍有待深入研究。

上所述，本研究通过生物信息学筛得到与骨质疏松的microRNA，靶因因功能分通路分析，在骨质疏松动物模型和氧化应激状态下的成骨细胞中，miR-32-3p可能通过调节成骨细胞的氧化应激反应，在骨质疏松中发挥重要作用。

这些分析骨质疏松的的因研究的向，其深入探究其发病机制。

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