红景天甙干预可改善慢性间断性缺氧模型小鼠的肺损伤

红景天甙干预可改善慢性间断性缺氧模型小鼠的肺损伤
皇甫志敏; 徐倩; 王晓; 王恩平; 冯玥; 曾娟; 朱锐; 赵春玲
【期刊名称】《《中国组织工程研究》》
【年(卷),期】2019(023)031
【总页数】5页(P5036-5040)
【关键词】红景天甙; 慢性间断性缺氧; 肺; 氧化应激; 凋亡; 活性氧
【作者】皇甫志敏; 徐倩; 王晓; 王恩平; 冯玥; 曾娟; 朱锐; 赵春玲
【作者单位】西南医科大学基础医学院四川省泸州市 646000; 西南医科大学临床医学院四川省泸州市 646000
【正文语种】中文
【中图分类】R446; R496; R318
0 引言 Introduction
慢性间断性缺氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是发生阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS)和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的关键环节，持续且反复发作的呼吸暂停和低通气将造成机体一系列器官的功能障碍和结构改变。

据研究统计，临床上二者并存发生率已达到75%，其发生可加重机体的炎症反应，进而引起更为严重的并发症，其对肺部、心脏、血管等器官的合并损伤可增大疾病的治愈难度，增加临床死亡率。

探究慢性间断性缺氧的发生发展机制是临床科学研
究的重点。

研究报道，红景天甙可以通过抑制凋亡途径对大鼠神经元细胞、人心肌细胞、胃癌细胞等起保护作用[1-4]，并对小鼠肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病均有一定的保护
作用[5-6]。

但对肺部病变途径以及红景天甙对慢性间断性缺氧所致肺损伤的药物
作用效果研究颇少，药物的合理应用可以减缓疾病进程，改善患者生存质量，该研究旨在观察慢性间断性缺氧肺损伤小鼠的氧化应激反应和细胞凋亡情况，并探索使用红景天甙进行干预后对慢性间断性缺氧肺损伤的影响以及相关可能机制，为临床治疗用药基础提供实践支撑。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年3月至2019年1月在西南医科大学肾功能保护中心完成。

1.3 材料
1.3.1 实验动物野生型C57BL/6雄性小鼠，购于成都达硕实验动物有限公司，许
可证号SCXK(川)2015-030。

小鼠饲养方法及所有动物实验操作遵循西南医科大学动物实验及相关操作管理规定，遵循实验动物伦理审查指南。

1.3.2 实验用主要药品、试剂及仪器红景天甙(成都德思特生物科技有限公司，CAS号：10338-51-9，纯度≥98%，粉剂，易溶于生理盐水)；苏木精-伊红染色
试剂盒(G1120)、BCA蛋白定量试剂盒(PC0020)、牛血清白蛋白BSA-Ⅴ(A8020)购于索莱宝生物科技有限公司；ROS试剂盒(上海杰美，GMS10016.2)；一抗Caspase-3(13847)、Bax (32503)、Bcl-2(692)、β-actin(8226)购于abcam公司；二抗anti-Mouse、anti-Rabbit(li-cor)；RIPA裂解液(P0013B)、PMSF蛋白酶抑制剂(ST506)、一抗稀释液(P0023A)购于碧云天生物技术有限公司；组织切片机(leica，德国)；倒置显微镜(Olympus，日本)低温高速离心机(Eppendorf，德国)；
Odyssey红外荧光成像系统(Li-cor，美国)；紫外可见光分光光度计(Thermo，美国)；凝胶电泳仪(Bio-rod，美国)
1.4 实验方法小鼠慢性间断性缺氧模型制备及分组参照Ding等[7]实验制作慢性
间断性缺氧模型，将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组，每组10只。

各组处理如下：正常对照组小鼠常氧24 h连续30 d；红景天甙组小鼠常氧24 h、连续
灌胃红景天甙50 mg/(kg·d)给药30 d；慢性间断性缺氧组小鼠每天间断性缺氧8 h(上午8时至下午4时)，缺氧舱维持8%-10%氧浓度1 min后迅速转为常氧浓度(19%-21%) 2 min连续30 d；慢性间断性缺氧+红景天甙组缺氧处理与慢性间断性缺氧组相同，灌胃处理与红景天甙组相同。

所有小鼠自由饮食饮水。

实验动物造模过程的相关问题造模目的：研究旨在观察慢性间断性缺氧肺损伤小鼠的氧化应激反应和细胞凋亡作用借鉴已有标准实施动物造模：参考文献[7]制作慢性间断性缺氧模型选择动物的条件：①野生型C57BL/6 小鼠；②雄性动物来
源及品系：C57BL/6 小鼠购于成都达硕实验动物有限公司造模技术描述：慢性间断性缺氧小鼠每天间断性缺氧8 h(上午8时至下午4 时)，缺氧舱维持8%-10%氧浓度1 min后迅速转为常氧浓度(19%-21%)2 min 连续30 d 动物数量及分组方法：40 只C57BL/6 小鼠随机分为4 组：正常对照组n=10；红景天甙组n=10；慢性间断性缺氧组n=10；慢性间断性缺氧+红景天甙组n=10 造模成功评价指标：对慢性间断性缺氧小鼠肺组织氧化应激水平及内源性凋亡相关蛋白进行检测发现，小鼠肺组织中活性氧水平明显升高，肺组织出现中小动脉管壁增厚，肺泡大小不均，部分肺泡出现破裂，管腔受损造模后实验观察指标：①肺组织病理学变化；②氧
化应激活性氧活性；③凋亡蛋白水平造模后动物处理：实验结束后麻醉小鼠放血
处死，取小鼠肺叶伦理委员会批准：实验项目经西南医科大学动物实验伦理委员
会批准(批准号：20150315121)
1.5 主要观察指标
1.5.1 苏木精-伊红染色观察肺组织病理学变化实验结束将各组小鼠麻醉后放血处死，无菌操作下取每组小鼠肺叶放入40 g/L多聚甲醛中固定36 h，石蜡包埋后切片(4 μm)进行苏木精-伊红染色，染色具体操作参照试剂说明，中性树脂封固，光学显微镜下观察小鼠肺组织学改变。

1.5.2 荧光化学法定性定量检测氧自由基活性氧活性取各组小鼠新鲜肺组织做冰冻切片(10 μm)，按照活性氧冰冻切片初级荧光定性检测试剂说明方法进行染色。

预冷清洗液清洗切片，加入荧光染色工作液避光孵育20 min，再次清理液清洗后盖上盖玻片封固。

荧光显微镜以激发波长为490 nm拍照观察。

活性氧定量分析参照说明，每组小鼠取相同质量肺组织，清洗液浸漂后采用玻璃匀浆器冰上匀浆，匀浆后50 μL透亮组织液加入200 μL荧光工作液避光孵育60 min，使用荧光酶标仪以540 nm激发光检测活性氧活性，同时使用BCA蛋白浓
度检测试剂盒检测相应样品蛋白浓度，荧光测定值/蛋白浓度为最终校正后活性氧
定量值。

1.5.3 Western-blot法检测凋亡蛋白水平各组小鼠取等量肺组织加入RIPA裂解
液(含1%蛋白酶抑制剂)冰上匀浆，匀浆后低温高速离心取上清液。

参照BCA试剂盒说明对各组蛋白浓度进行定量。

各组蛋白样品变性后以浓缩胶5%、分离胶10%浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，将分离胶蛋白湿转到PVDF膜上，5%BSA室温摇床慢摇封闭1 h，加入一抗室温摇床孵育半小时，4 ℃过夜；隔日
取出用TBST洗膜4次，每次5 min；加入二抗避光孵育1 h；TBST避光洗膜4次，每次5 min；使用Odyssey红外荧光系统进行显影，用Image Studio Lite
软件进行条带灰度值分析。

一抗浓度：Caspase-3 1∶500、Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、β-actin 1∶2 000；二抗浓度：1∶2 000。

1.6 统计学分析实验数据属于计量资料，所有统计数据采用±s描述。

使用软件SPSS 17.0进行数据分析，Graph Pad Prism 6.01作图。

多组比较采用单因素方
差分析，统计学检验效能设置为P ＜ 0.05。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠40只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 肺组织病理学检测正常对照组、红景天甙组小鼠光镜下观察肺组织结构正常清晰，肺小动脉管壁薄腔大，肺泡均一；慢性间断性缺氧组与正常对照组比较出现肺小动脉中膜平滑肌增厚，管壁扩增明显，结蹄组织增多，肺泡及细支气管扩张；慢性间断性缺氧+红景天甙组较慢性间断性缺氧组损伤明显减弱，中小动脉损害减轻，但较红景天甙组损伤加重。

见图1。

2.3 氧化应激指标活性氧定性定量分析慢性间断性缺氧组荧光强度明显高于正常对照组、红景天甙组和慢性间断性缺氧+红景天甙组；正常对照组与红景天甙组荧光强度差异无显著性意义(P＜ 0.05)。

定量与定性分析结果一致。

见图2。

2.4 肺组织凋亡相关蛋白变化 Western-blot结果显示，正常对照组与红景天甙组各蛋白水平差异无显著性意义(P ＞ 0.05)。

慢性间断性缺氧组蛋白凋亡标志Caspase-3、促凋亡蛋白Bax及凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值显著高于正常对照组和红景天甙组(P ＜ 0.05)；慢性间断性缺氧+红景天甙组上述蛋白水平及Bax/Bcl-2比值显著低于慢性间断性缺氧组(P＜ 0.05)；慢性间断性缺氧+红景天甙组抗凋亡蛋白Bcl-2显著高于慢性间断性缺氧组(P＜ 0.05)，显著低于正常对照组和红景天甙组(P ＜ 0.05)。

见图3。

3 讨论 Discussion
慢性间断性缺氧的发生会引起血流氧分压或氧含量周期性的下降和恢复，组织因反复循环缺氧将介导一系列病理生理反应，这是阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征导致全身器官损害的主要过程。

近年，中药治疗越来越广泛地应用在临床中，如黄芪甲苷、姜黄素等[8-9]，其对于慢性疾病的治疗效果甚佳。

红景天甙是景天科植物
红景天的根、根茎分离提取后最有效的药物作用成分，它特殊的生长环境，即高山高原阳光充足地区，使其具有天然的抗氧化、抗炎、抗衰老、抗辐射作用[10-11]。

已有研究表明，红景天甙的抗氧化功能通过清除氧自由基而发挥作用[12]，在乳鼠海马神经元缺氧模型中，红景天甙通过抑制缺氧诱导因子1α的表达来达到抗凋亡的作用[13]；在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，红景天甙治疗组的心肌细胞凋亡指数和促凋亡蛋白Bax的表达下降，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-2/Bax上升，结果表明红景天甙通过对凋亡蛋白的调控实现保护作用[14]。

红景天甙对心、脑以及血管等抗氧化和抗凋亡作用已有研究证实，但对于慢性肺损伤的作用研究较少，此次研究主要从氧化应激反应和凋亡蛋白检测两个方面，探讨红景天甙对小鼠慢性间断性缺氧肺损伤的影响。

图1 各组小鼠肺组织苏木精-伊红染色结果(×200) Figure1 Hematoxylin-eosin staining in mouse lung tissue of each group (×200) 图注：图A 为正常对照组；
B 为红景天甙组；
C 为慢性间断性缺氧组；
D 为慢性间断性缺氧+红景天甙组。

慢性间断性缺氧+红景天甙组较慢性间断性缺氧组损伤明显减轻，中小动脉损害减轻，但较红景天甙组损伤加重。

图2 红景天甙对各组小鼠肺组织活性氧表达的影响 Figure2 Effect of salidroside on the expression of oxygen free radical in mouse lung tissue of each group 图注：图A 为正常对照组(×200)；B为红景天甙组(×200)；C 为慢性间断性缺氧组(×200)；D 为慢性间断性缺氧+红景天甙组(×200)；E 活性氧表达统计学分析，1：正常对照组；2：红景天甙组；3：慢性间断性缺氧组；4慢性间断性缺氧+红景天甙组。

与正常对照组相比，aP＜0.05；与红景天甙组相比，bP＜0.05；与慢性间断性缺氧组相比，cP＜ 0.05。

图3 红景天甙对小鼠肺组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3 表达的影响 Figure3 Effect of salidroside on the expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in
mouse lung tissue of each group 图注：1：正常对照组；2：红景天甙组；3：慢性间断性缺氧组；4慢性间断性缺氧+红景天甙组。

图A为电泳图；B 为Bax 表达分析；C为Bcl-2 表达分析；D 为Caspase-3表达分析。

与正常对照组相比，aP＜0.05；与红景天甙组相比，bP＜0.05；与慢性间断性缺氧组相比，cP＜0.05。

细胞凋亡分为内源性和外源性两大途径，外源性凋亡与死亡受体相关通路有关，内源性途径常与线粒体损害相关，此次研究的重点为细胞凋亡的内源性(线粒体)途径。

活性氧是一类具有超高生物学活性的含氧化合物，主要产生于线粒体。

生理条件下活性氧含量较低，机体通过调控氧化和抗氧化水平维持细胞内环境的平衡。

组织发生缺氧时，大量产生的活性氧可破坏生物膜系统并直接与线粒体DNA接触造成其双链断裂和丢失[15-17]，DNA的损伤激活膜上Bcl-2家族的促凋亡蛋白，同时线粒体跨膜电位改变以及膜外渗透性增加，诱导细胞色素C的释放并活化Caspase-3，Caspase-9等，caspase-3作为Caspase家族一员在介导细胞凋亡中是关键
的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥重要功能，Caspase-3在凋亡
早期可直接被激活裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[18-19]。

此次研究对慢性间断性缺氧时肺组织氧化应激水平及内源性凋亡相关蛋白进行检测发现，小鼠慢性间断性缺氧组肺组织中活性氧水平明显升高，肺组织出现中小动脉管壁增厚，肺泡大小不均，部分肺泡出现破裂，管腔受损。

给予红景天甙灌胃后，小鼠慢性间断性缺氧肺损伤程度减轻，相应活性氧水平降低，可证实红景天甙可以通过降低活性氧活性减轻慢性间断性缺氧造成的肺部损伤。

此外，线粒体膜上存在大量Bcl-2家族蛋白，这些家族成员的促凋亡或抗凋亡结构域，可直接被活性氧或凋亡信号分子识别并激活，抗凋亡效应蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax比值最终决
定了细胞凋亡或存活。

此次实验结果显示，Casepase-3蛋白表达慢性间断性缺氧组高于正常对照组、红景天甙组和慢性间断性缺氧+红景天甙组，表明慢性间断性缺氧启动了肺凋亡途径。

此外，慢性间断性缺氧组促凋亡蛋白Bax水平与正常对
照组、红景天甙组和慢性间断性缺氧+红景天甙组比均升高；慢性间断性缺氧组抗凋亡效应蛋白Bcl-2水平低于正常对照组、红景天甙组和慢性间断性缺氧+红景天甙组，Bcl-2/Bax比值下降，表明发生慢性间断性缺氧时，肺组织促凋亡水平大于抗凋亡水平，而通过给药后发现，红景天甙可促进抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，抑制Casepase-3水平和促凋亡蛋白Bax的表达，从而抑制细胞凋亡减轻小鼠慢性间断性缺氧肺损伤。

以往研究中发现，红景天甙不仅对于低氧引起的大鼠心肌细胞损伤具有保护作用[2]，还能抑制肺内皮细胞、以及肺血管平滑肌细胞中的缺氧诱导因子的表达发挥保护作用[20]。

此次实验进一步明确了红景天甙作用慢性间断性缺氧肺损伤的内源性凋亡途径可能机制，其可以通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡达到对小鼠慢性间断性缺氧肺损伤的保护作用，但对于更为广泛的相关分子通路作用途径没有详细研究，对于细胞凋亡的检测方法单一，可在后续研究加以体外实验，多角度多维度的对其进行论证，这为之后的研究提供实验基础，为指导临床用药提供更可靠的实验用药依据。

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