银纳米线与BSA相互作用的光谱学研究

银纳米线与BSA相互作用的光谱学研究
刘雯; 高硕; 朱帅; 杜中玉; 毛旭艳; 姜靓; 杨林青; 徐香玉
【期刊名称】《《化学研究》》
【年(卷),期】2019(030)004
【总页数】6页(P372-377)
【关键词】银纳米线; 牛血清白蛋白; 荧光光谱; 荧光猝灭
【作者】刘雯; 高硕; 朱帅; 杜中玉; 毛旭艳; 姜靓; 杨林青; 徐香玉
【作者单位】济宁医学院基础医学院山东济宁272067; 济宁医学院临床医学院山东济宁272067; 江南大学药学院江苏无锡214122; 济宁医学院生物纳米技术与医学工程研究所山东济宁272067; 济宁医学院附属医院妇癌精准诊疗科研创新团队山东济宁272067
【正文语种】中文
【中图分类】O657.3
纳米线是直径在100 nm 以下的一维纳米材料，其在医药、生物、化学等各个领域均有广泛的应用.有研究表明，具有独特的光、电和磁性的纳米颗粒可能在未来的生物学分析、诊断和治疗中发挥重要作用[1].自从金属纳米材料研制成功以来，银纳米粒子因具有优良的吸附能力和抗菌活性而成为研究的热点之一[2-3].纳米银的特殊物理和化学性质使之在微电子、光电子、超导材料、生物医药、催化以及医学应用方面备受关注[4-5].银纳米线可以将蛋白质吸附到表面，发生结合从而可能
改变蛋白质的构象，因此研究纳米银与蛋白质之间的相互作用显得尤为重要[6-8]. 蛋白质是生物体生命活动的基础，它的复杂多层次三维构象是其生物活性和免疫活性的重要基础保证[9-11].牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 是牛血清中的球状蛋白，它也是生物大分子研究中应用最广泛的蛋白质之一.牛血清白蛋白常用作研究蛋白质与药物、配体、金属离子等物质相互作用的最理想的模型.其具有很好的生物相容性，可与多种内源性物质(如代谢物等)和外源物质(如药物)等结合[12-14].
由于纳米材料在生物医学领域的应用，更深入的理解这些纳米材料在生物体液中如何扩散以及如何与蛋白质发生相互作用很有必要.纳米材料进入生物体后与蛋白质等生物大分子之间会发生不同强度的相互作用，且此相互作用是一个动态过程，只有对此过程有清楚的认识，才能更好地使用此类纳米材料.另外，若想在体内安全使用这种复合材料，需明确其在体内的代谢过程，这首先需要了解不同核酸与纳米复合物的相对亲和力.欲准确表达这种亲和力，须对此过程的热力学参数(熵变、焓变、吉布斯自由能变、结合平衡常数等)进行系统的综合研究.基于上述原因，本论文系统地研究了一维银纳米线与BSA 的相互作用，得到相应的热力学参数，对银纳米材料与生物大分子相互作用的理论基础具有一定的指导作用.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
电子天平(EL 204，梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士)，紫外分光光度计(岛津UV-2501 PC，日本)，荧光光度计(日立 F-4600，带恒温样品支架，型号为250-0346，日本)，扫描电子显微镜(SEM) (Zeiss, 德国).
60 nm 的银纳米线(济宁利特纳米技术有限责任公司)；三羟甲基氨基甲烷(纯度为99%，阿法埃莎化工有限公司)；NaCl (国药集团化学试剂有限公司)；EDTA (北京拜尔迪生物技术有限公司)；HCl (莱阳经济技术开发区精细化工厂)；牛血清白蛋
白(纯度98%, Mw=66.4 kg·mol-1,百灵威)；Tris 缓冲溶液 (pH=7.40)；BSA 溶液在4 ℃ 冰箱中保存；试验中所用的水均为3次去离子水.
1.2 实验方法
1.2.1 紫外光谱测定
扫描范围为200～900 nm，以1 200 nm/min 的速度测定溶液的吸光度.固定比色皿中牛血清白蛋白的浓度为0.8 μmol/L，改变银纳米线的浓度依次为：0, 0.15,
0.46, 0.77, 1.10, 1.40, 1.70, 2.00 mmol/L.
1.2.2 荧光光谱测定
激发波长为285 nm，相对应的扫描波段为300～520 nm，发射和激发狭缝的宽度均设定为5 nm.固定比色皿中BSA 溶液的浓度为0.8 μmol/L，银纳米线的浓度同1.2.1 部分.
1.2.3 同步荧光光谱测定
将银纳米线与BSA 的混合溶液分别在Δλ = 60 nm (Δλ = λem-λex，激发波长为240 nm，发射波长从300～400 nm) 和Δλ = 15 nm (激发波长为265 nm，发射波长为从280～340 nm)测定荧光强度，BSA 的浓度为0.8 μmol/L，银纳米线的浓度同1.2.1 部分.
1.2.4 变温荧光光谱测定
变温荧光是测定银纳米线与BSA 结合能力大小及结合位点的有效方法，本实验测定了当激发波长为295 nm 时，60 nm 的银纳米线与BSA 在293、298、303、308、310 K 时的荧光强度，其中保持BSA 的浓度为0.8 μmol/L，银纳米线的浓度同1.2.1 部分.
2 结果与讨论
2.1 银纳米线与BSA 的相互作用
2.1.1 紫外光谱分析
紫外光谱法是研究物质之间相互作用的最有效方法.金属粒子在紫外可见光区有吸收带或者吸收区，这是由于等离子共振激发或者带间跃迁形成的吸收.图1a 是本实验得到的银纳米线的紫外可见光谱图.由图可知，银纳米线在370 nm 处有最大吸收峰.由图1b 可以得知银纳米线具有均匀的线状结构.图2 为纳米银与BSA 在缓冲溶液中相互作用的紫外吸收光谱图.由实验结果可知，空白BSA 溶液的吸收峰在280 nm 左右，随着不同浓度银纳米线溶液的加入，BSA 的紫外吸收强度随之有规律地递增，即随着银纳米线浓度的增加，BSA 的溶液发生了增色效应.这些实验结果表明，银纳米线与溶液中的BSA 发生了相互作用.
图1 (a) 银纳米线的紫外吸收光谱图；(b) 银纳米线的SEM表征Fig.1 (a) UV-vis spectrum of silver nanowires； (b) SEM characterization of silver nanowires 注：银纳米线的浓度依次为a-h：0, 0.15, 0.46, 0.77, 1.10, 1.40, 1.70, 2.00 mmol/L图2 银纳米线与BSA相互作用的紫外吸收光谱图Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of the interaction between silver nanowires and BSA 2.1.2 荧光光谱分析
图3 是一系列浓度的银纳米线与固定浓度的BSA 相互作用的荧光光谱图.在BSA 分子中，存在有三个固有的荧光残基：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe).BSA 与其他物质相互作用而导致其荧光强度降低的现象称为荧光猝灭[15].由图3 可以看出，随着溶液中银纳米线浓度的增大，BSA 的荧光强度明显降低.结合紫外光谱图，可以得知60 nm 粒径的银纳米线可以与BSA 发生相互作用，使其最大荧光强度发生改变.
注：银纳米线的浓度依次为a-h：0, 0.15, 0.46, 0.77, 1.10，1.40，1.70，2.00 mmol/L图3 银纳米线与BSA相互作用的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence spectra of the interaction between silver nanowires and BSA
2.1.3 同步荧光光谱分析
同步荧光法是研究BSA 最常用的方法，可以研究BSA 在环境变化时构象的变化.当Δλ为60 nm 时，观察到的是色氨酸的特征荧光；而当Δλ为15 nm 时，显示的是酪氨酸残基的特征荧光[16].图4是在温度为298 K，pH为7.40的Tris缓冲溶液中测得的酪氨酸和色氨酸的同步荧光光谱图.图4 (a) 是发射波长设置为265 nm，激发波长的范围设置为280～340 nm时(Δλ=15 nm) 的荧光光谱图，此时得到的是酪氨酸残基的特征光谱图；图4 (b) 是发射波长为240 nm，激发波长的范围为300～400 nm 时(Δλ=60 nm) 的荧光光谱图，此时得到的是色氨酸残基的特征光谱图.由图4 (a)、(b)可知，当Δλ=15 nm 时，随着溶液中银纳米线浓度的增加，BSA 的荧光强度发生了变化，但是酪氨酸残基的位置并没有发生变化；反观Δλ=60 nm 时，随着Ag 的浓度的增加，最大荧光强度不仅发生了变化，色氨酸残基的位置也发生了红移，这说明银纳米线的加入使蛋白质的构象发生了变化，色氨酸残基周围的环境也发生了改变.
银纳米线的浓度依次为a-h： 0, 0.15, 0.46, 0.77, 1.10, 1.40, 1.70, 2.00 mmol/L 图4 BSA 的同步荧光光谱图(a) Δλ=15 nm, (b) Δλ=60 nmFig.4 Synchronized fluorescence spectra (a) Δλ= 15 nm (b) Δλ= 60 nm for BSA
2.2 变温荧光光谱分析
2.2.1 荧光猝灭机制探讨
由图3、图4 可以看出，Ag 的加入使得BSA 发生了荧光猝灭效应.为进一步探讨BSA 发生的是何种荧光猝灭过程，对60 nm 的银纳米线与BSA 的混合溶液做了变温荧光实验.实验中为了消除杂质的影响，对荧光强度进行了校正，校正公式如下：
Fcor=Fobs×e(Aex+Aem)/2
(1)
Fcor 和Fobs 分别是校正后的和观察到的荧光强度.Aex 和Aem 分别是银纳米线
和BSA 在激发波长和发射波长下吸收强度.
一般将荧光猝灭过程分为静态猝灭和动态猝灭，用Stern-Volmer 方程[17]来判断是何种猝灭方式：
(2)
其中：F0 是未加入银纳米线时的BSA 荧光强度；F 是加入银纳米线且校正后的BSA 荧光强度；KSV 是Stern-Volmer 猝灭常数；Kq 为猝灭速率常数；τ0是BSA 的平均寿命，其数值约为10-9 s.利用Stern-Volmer 方程，通过F0/F 对[Q] 作图，可以确定KSV 的数值.由表1中计算出的Kq 与BSA 的最大扩散碰撞的动态猝灭常数2.0×1010 L/(mol·s) 的比较可以断定，猝灭剂银纳米线对BSA 的猝灭过程均为静态猝灭过程.
表1 银纳米线与BSA 混合溶液在的Stern-Volmer 猝灭常数Table 1 Stern-Volmer quenching constants of silver nanowires mixed with BSA
静态猝灭过程中的结合常数Ka 和结合位点n 都可以用double-logarithm中的lg[(F0-F)/F] 和lg[Q]的斜率及截距求出，如下所示：
(3)
由方程(3) 可以得出lg[(F0-F)/F)] 和lg[Q]的关系(见图5)，由该图可以得到相应的结合常数和结合位点数目(见表2).由此表可见，随着温度的升高，结合常数和结合位点数均减小，表明BSA 与银纳米线的结合能力降低.
图5 在不同温度下银纳米线对BSA 猝灭的double-logarithm图Fig.5 Double-logarithm diagram of silver nanowires quenching BSA at different temperatures表2 银纳米线与BSA 溶液在不同温度下的结合常数和结合位点Table 2 Binding constants and binding sites of silver nanowires and BSA
mixed solutions at different temperatures
粒径/nmT/K Ka/(L·mol-1)n602934 268.51.62981
325.71.4303179.11.230897.71.131051.31.0
2.2.2 热力学数据分析
银纳米线与BSA 之间的作用力属于分子间的弱相互作用，包括氢键、疏水作用力、静电引力和范德华力等[18].在反应前后温度变化不大时，ΔH⊖可视为常数，其自由能和稳定常数之间的关系满足下述公式：
ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK
(4)
(5)
式中，ΔG为吉布斯自由能变，ΔH 为焓变，ΔS 为熵变，K 为平衡常数.
根据反应前后热力学焓变和熵变的相对大小，可以确定银纳米线与BSA 之间的相
互作用类型.ROSS 等总结了小分子与生物大分子反应的热力学数据与作用力类型
的关系，即当ΔH⊖大于0，ΔS⊖大于0时为疏水作用；ΔH⊖小于0，ΔS⊖小于0时为范德华力和氢键；ΔH⊖小于0，ΔS⊖大于0时为静电作用力.由银纳米线与BSA 相互作用的热力学数据，如表3 所示，ΔH 小于0，ΔS 小于0，可知银纳米
线与BSA 之间作用力的类型主要范德华力和氢键.又因为ΔG 小于0，所以二者之间的相互作用为自发进行.
表3 银纳米线与BSA 相互作用的热力学数据Table 3 Thermodynamic data of interaction between silver nanowires and BSAT/KK/(kJ·mol-1)ΔG(/kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K)ΔH/(kJ·mol-1)2934 268.5-20.362981 325.7-17.81303179.1-13.07-726.9-233.730897.7-11.7331051.3-10.15
3 结论
本论文主要通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱探究了60 nm 的银纳米线与BSA 之间的相互作用.紫外-可见吸收光谱结果表明，随着溶液中银纳米线浓度的增加，BSA 的最大紫外吸收强度也随之增加，说明银纳米线可以与BSA 发生相互作用.荧光光谱分析可知，60 nm 粒径的银纳米线可以和BSA 发生猝灭反应，且猝灭机制为静态猝灭.银纳米线可以改变BSA 中色氨酸残基周围亲水环境的极性.同步荧光结果表明随着银纳米线浓度的增加，色氨酸残基的位置发生了红移，说明色氨酸残基周围的环境发生了变化，而酪氨酸残基的位置没有改变，表明酪氨酸残基周围的环境没有改变.由变温荧光光谱的分析可知，结合常数Ka 和结合位点数n 均随着温度的升高而降低，其结合能力减弱.
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