5-氮-2′-脱氧胞苷逆转膀胱癌细胞hepaCAM基因的表达及对其生长的抑制

5-氮-2′-脱氧胞苷逆转膀胱癌细胞hepaCAM基因的表达及
对其生长的抑制
刘琪;潘翠翠;徐新;张彦懿;吴小候;罗春丽
【摘要】目的研究5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-CdR)逆转hepaCAM表达及抑制膀胱癌细胞的生长.方法 MTT法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；RT-PCR 检测hepaCAM mRNA的表达.结果在T24细胞中,3.0和10.0 μmol/L5-aza-CdR药物浓度的抑制率明显高于0.3和1.0 μmol/L 5-aza-CdR(P＜0.05),在BIU-87细胞中,5.0 μmol/L5-aza-CdR药物浓度的抑制率明显高于0.1和0.5μmol/L(P ＜0.05),并且药物处理细胞72 h的抑制率明显高于24和48 h(P＜0.05)；5-aza-CdR处理细胞后,T24和BIU-87细胞凋亡数明显增加(P＜0.05)；并可逆转hepaCAMmRNA表达.结论 5-aza-CdR可使hepaCAM基因重新表达,并通过诱导凋亡而抑制膀胱癌细胞的生长.%Objective To investigate the effect of 5 -aza-CdR on expression of hepaCAM mRNA and the inhibition of T24 and BIU-87cell lines. Methods The effects of 5-aza-CdR on cell proliferation of T24 and BIU-87 cell lines were measured by MTT; Flow cytometry was used to examine apoptosis of T24 and BIU-87 cells; RT-PCR was used to detect the expression of hepaCAM in T24 and BIU-87 cell lines with or without 5-aza-CdR treatment. Results The inhibition ratios of 3.0 and 10.0 μmol/L 5-aza-CdR were significantly higher than that of 0.3 and 1. 0 μmol/L 5-aza-CdR in T24 cell (P 〈0. 05). The inhibition ratio of 5. 0 μmol/L 5-aza-CdR was higher than that of 0. 1 and 0.5 μmol/L 5-aza-CdR in BIU-87 cell (P 〈0.
05). Cell apoptotic rate increased in cells with 5-aza-CdR treatment (P 〈0.
05). The expression of hepaCAM mRNA was reversed in T24 and BIU-87
cells after treatment. Conclusions 5-aza-CdR can reverse the expression of hepaCAM mRNA and therefore inhibit the cell growth through inducing apoptosis in bladder cancer tissue.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2013(033)001
【总页数】5页(P55-59)
【关键词】5-aza-CdR;hepaCAM;膀胱癌;细胞凋亡
【作者】刘琪;潘翠翠;徐新;张彦懿;吴小候;罗春丽
【作者单位】重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室重庆市重点实验室,重庆400016;重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验
室重庆市重点实验室,重庆400016;重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育
部重点实验室重庆市重点实验室,重庆400016;重庆医科大学检验医学院临床检验
诊断学教育部重点实验室重庆市重点实验室,重庆400016;重庆医科大学附属第一
医院泌尿外科,重庆400016;重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点
实验室重庆市重点实验室,重庆400016
【正文语种】中文
【中图分类】R979.1;Q786;R737.14;Q255
肿瘤发生的分子机制主要有3种类型:基因突变、基因缺失和表观遗传学改变［1］。

而表观遗传学改变又主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化［2］。

其中DNA甲基化改变分为全基因组水平的低甲基化和 CpG岛 DNA高甲基化
［3］;CpG岛的异常高甲基化主要发生于抑癌基因启动子区域。

故抑癌基因在肿
瘤中的失活可归结于其基因启动子区域CpG岛的异常高甲基化。

DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNMT)催化形成，是在不改变核酸序列的情况下，调节基因表达的不可逆过程［4］。

5-氮-2'脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)是DNMT的抑制剂，可以逆转抑癌基因的甲基化，使其重新表达［5］。

在很多其他肿瘤研究中，例如结肠癌［6］、前列腺癌［7］等，5-aza-CdR都可在一定程度上逆转抑癌基因的甲基化并抑制肿瘤生长。

肝细
胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule，hepaCAM)，作为一个抑癌基因，在膀胱癌中表达低下，并且在体外研究中发现hepaCAM具有抑制膀胱癌生
长的作用［8－9］。

因此，本研究以hepaCAM为出发点，探究5-aza-CdR是否也能逆转hepaCAM基因在膀胱癌细胞中的表达，并与hepaCAM一起发挥抑制
肿瘤生长的作用。

1 材料与方法
1.1 材料
人膀胱癌细胞T24(重庆医科大学传染病研究所惠赠)，BIU-87细胞系(武汉大学细胞库)。

5-aza-CdR、MTT试剂和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);RNA提取试
剂盒Trizol和RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程);PCR引物(Invitrogen公司);细胞
培养基RPMI1640和新生牛血清(Gibco公司);细胞凋亡检测试剂(重庆医科大学儿研所流式细胞实验室提供)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养:T24和BIU-87细胞培养于含有10%新生牛血清的RPMI1640培
养基中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。

将细胞以1×106个/孔的密度种于6孔板中，待细胞生长汇合度达到80%～90%，按照总RNA提取步骤提取RNA，保存于－80℃，为后续实验准备。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞增殖的影响:取对数期生长的T24和BIU-87细胞，经胰蛋白酶消化制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104个/mL，接种于96孔板中，最后补充培养基至200 μL。

每组设5个复孔，同时接种3个96孔板，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24 h。

实验分为6组:T24(调零组、未处理组、0.3、1.0、3.0 和10.0 μmol/L)，BIU-87(调零组、未处理组、0.1、0.5、1.0 和5.0 μmol/L)。

加药后3个板分别继续培养24、48和72 h。

弃上清，每孔加入20 μL的MTT(5 g/L)继续培养4 h后，小心吸去上清，加入DMSO 200 μL，振荡孵育15 min，全自动酶标仪(570 nm)检测各孔的吸光度(A值)。

计算各组细胞生长抑制率，公式如下:抑制率(%)=［1－(A 处理－A调零)/(A对照－A调零)］×100%。

1.2.3 反转录-聚合酶链反应检测hepaCAM mRNA的表达:分别用不同浓度的5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞，未用药物处理作为对照，培养24、48和72 h后收集细胞，提取RNA，用反转录试剂盒将mRNA逆转为cDNA，RT-PCR检测5-aza-CdR处理前后T24和BIU-87细胞中hepaCAM表达的变化。

PCR反应条件:hepaCAM:95℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min共35个循环;72℃继续延伸5 min。

β-actin:95℃预变性5 min;94℃ 变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30个循环;72℃继续延伸5 min。

hepaCAM上游引物是5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'，下游引物是5'-CTTCTGGTTTCAGGCGGTC-3'，扩增产物为461 bp。

β-actin上游引物是5'-ACGAGACCACCT TCAACTCCATC-3'，下游引物是5'-TAGAAGCATTTG CGGTGGACGA-3'，扩增产物片断为307 bp。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡:收集细胞，固定于70%冷乙醇(in PBS)中，4℃固定过夜，磷酸二氢盐缓冲液(PBS)洗涤，1 000 r/min离心10 min，RNase A(0.5 g/L)37℃ 消化30 min，加入 PI(50 g/L)染色，室温避光15 min，FACScan分析
DNA亚2倍体的形成及细胞凋亡的变化。

1.3 统计学分析
用统计学软件SPSS16.0分析，结果以均数±标准差)表示，组间均数比较采用SNK法检验，ANOVA分析和t检验分析hepaCAM表达量。

2 结果
2.1 MTT法检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞增殖的影响
5-aza-CdR呈剂量依赖性抑制了T24与BIU-87细胞的增殖。

在T24与BIU-87细胞中，药物处理细胞72 h的抑制率明显高于24和48 h(P＜0.05)(图1)。

2.2 RT-PCR检测5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞后hepaCAM mRNA的表达
经5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞后，hepaCAM表达呈剂量依赖性和时间依赖性 (图2，表1，2)。

2.3 流式细胞术检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞凋亡的影响
5-aza-CdR处理T24和BIU-87细胞后，明显增加了凋亡细胞数，呈时间依赖性(P＜0.05)(图3)。

3 讨论
2010年，全球新增35.7万个膀胱癌病例，并有14.5万个人死于膀胱癌。

90%以上的膀胱癌为移行细胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder，TCCB)，5% 为鳞状细胞癌，2% 为腺癌［10－11］。

75%的TCCB为非肌肉侵袭性的，具有高复发率，且容易发展为高度恶性肿瘤［12］;而肌肉侵袭性 TCCB(25%)预后不良［13］，经过2年治疗后，50%患者会发生肿瘤转移［14］。

尽管外科手术治疗，膀胱内免疫、化学治疗，以及一些新型化疗方法(如酪氨酸激酶抑制剂、抗血管生成药物等)应用于膀胱癌，但患者的生存率并未提高［14］。

而在过去十几年
中，众多研究都致力于寻找一种无创伤，特异性强并具有靶
向性的分子生物学治疗方法。

这个工程巨大、过程复杂、冗长，所以找到一种综合性的方法，更是亟待解决的问题。

表1 5-aza-CdR作用不同时间对T24和BIU-87细胞hepaCAM mRNA的影响Table 1 The effect of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM mRNA of T24 and BIU-87 cells in different times，A value，n=4)＊P ＜0.05 compared with blank，24 or 48 hours．group T24(3 μmol/L 5-aza-CdR) BIU-87(5
μmol/L 5-aza-CdR)blank 0.027±0.003 0.146±0.002 24 hours 0.032±0.001 0.098±0.003 48 hours 0.036±0.002 0.104±0.000 72 hours 0.716±0.008* 0.536±0.002*
表2 72 h时不同药物浓度的5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞hepaCAM mRNA的影响Table 2 The effect of different concentrations of 5-aza-CdR on expression of hepaCAM of T24 and BIU-87 cell lines for 72 hours，A value，n=5)#P ＜0.05 compared with blank or 0.3 or 1.0 μmol/L 5-aza-CdR;*P ＜0.05 compared with blank or 0.1 or 0.5 or 1.0 μmol/L 5-aza-CdR．group T24 group BIU-87 blank 0.030±0.000 blank 0.196±0.002 5-aza-CdR 5-aza-CdR 0.3 μmol/L 0.028 ±0.001 0.1 μmol/L 0.197 ±0.006 1.0 μmol/L 0.037 ±0.002 0.5 μmol/L 0.178 ±0.002 3.0 μmol/L 0.164 ±0.008# 1.0 μmol/L 0.147 ±0.028 10.0 μmol/L 0.201 ±0.002# 5.0 μmol/L 0.647
±0.007*
图3 流式细胞技术检测5-aza-CdR对T24和BIU-87细胞凋亡的影响Fig 3 The effect of 5-aza-CdR on apoptosis of T24 and BIU-87 cell lines was detected by FCM*P＜0.05 compared with blank;#P＜0.05 compared with 48 hours;A.BIU-87 cell;B.T24 cell
5-aza-CdR是一种去甲基化药物，可以抑制抑癌基因的甲基化，使众多抑癌基因重新表达。

迄今已有临床Ⅰ，Ⅱ期试验证实，在实体瘤中，如卵巢癌、雄激素依赖的前列腺癌、子宫颈癌等，5-aza-CdR难以达到预期的有效治疗作用，后续的药物效力仍在研究中;在血液的恶性肿瘤临床Ⅰ，Ⅱ期实验中，5-aza-CdR单剂量就对急性白血病有疗效，对进展中的慢性粒细胞白血病有中等的疗效［7］。

但5-aza-CdR在膀胱癌中的研究和应用甚少，故本研究先从体外实验出发，用不同浓度的5-aza-CdR处理膀胱癌T24和BIU-87细胞，发现5-aza-CdR可以抑制体外膀胱癌细胞的增殖，并可促使细胞凋亡;另一方面，从抑癌基因hepaCAM角度出发，发现5-aza-CdR可使hepaCAM基因重新表达。

hepaCAM自2005年发现以来，一直都在研究其结构和功能［8－9］，至于它在肿瘤组织中表达低下或缺失的原因研究较少。

本研究发现5-aza-CdR可逆转 hepaCAM基因表达，而5-aza-CdR又是DNA甲基转移酶的抑制剂，可逆转抑癌基因的甲基化，那么5-aza-CdR使hepaCAM重新表达的原因是否会由于5-aza-CdR逆转了抑癌基因hepaCAM的甲基化;5-aza-CdR对膀胱癌细胞的抑制作用也是否也源于hepaCAM基因的重新表达，或者是其单纯的抑制作用，又或者有两种机制一起作用，这些问题都需要进一步的研究。

然而，5-aza-CdR应用于膀胱癌，可使很大一部分的抑癌基因得到重新表达，从另个方面又增强了抑制肿瘤生长的作用，故设想若结合精确的手术治疗，常规化疗，以及新型的药物治疗，比如5-aza-CdR，可能会给膀胱癌治疗带来新的前景。

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