组织工程血管基质的制备及保存

组织工程血管基质的制备及保存
池一凡;许慧;林明山;侯文明;孙忠东;孙龙;牛兆倬;孙勇;生伟
【摘要】背景:为构建全生物化组织工程血管,制备及保存脱细胞血管基质.目的:制
备组织工程血管基质,观察其保存于液氮中的可行性.方法:采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理兔胸主动脉来制备组织工程血管基质,标本作大体、光镜及扫描
电镜、透射电镜观察,并将制备的血管基质放入液氮中保存,3个月后取出作扫描电
镜观察.结果与结论:经该法处理的兔血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好,液氮保存3个月后扫描电镜观察与新鲜基质无明显差别.提示酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备组织工程血管基质的较好方法,制备的血
管基质可放入液氮中进行短期保存.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2010(014)051
【总页数】4页(P9555-9558)
【关键词】血管基质;组织工程;兔胸主动脉;除垢剂;液氮保存
【作者】池一凡;许慧;林明山;侯文明;孙忠东;孙龙;牛兆倬;孙勇;生伟
【作者单位】青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071;
青岛大学医学院附属医院麻醉科,山东省,青岛市,266071;青岛大学医学院附属青岛
市立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071;青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏
外科,山东省,青岛市,266071;青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071;青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071;
青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071;青岛大学医学
院附属青岛市立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071;青岛大学医学院附属青岛市
立医院心脏外科,山东省,青岛市,266071
【正文语种】中文
【中图分类】R318
背景：为构建全生物化组织工程血管，制备及保存脱细胞血管基质。

目的：制备组织工程血管基质，观察其保存于液氮中的可行性。

方法：采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂法处理兔胸主动脉来制备组织工程血管基质，标本作大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察，并将制备的血管基质放入液氮中保存，3个月后取出作扫描电镜观察。

结果与结论：经该法处理的兔血管细胞全部脱除，胶原纤维、弹性纤维无断裂，细胞外基质保持完好，液氮保存 3个月后扫描电镜观察与新鲜基质无明显差别。

提
示酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法是制备组织工程血管基质的较好方法，制备的血管基质可放入液氮中进行短期保存。

组织工程血管是利用工程学和生命科学原理构建的生物血管。

组织工程血管研究的基本方法是：将体外培养扩增的细胞种植于天然或人工合成材料上，构建出模拟健康动脉结构移植物，用以取代病损血管组织而发挥正常功能[1-2]。

血管支架材料
在组织工程血管的构建中起到非常重要的作用。

目前支架材料的研究主要包括两大类：①以聚乳酸、聚乙醇酸及两者共聚物为代表的可降解高分子合成材料构建组织工程血管支架。

②以生物来源的材料如胶原、纤维蛋白及脱细胞基质等构建血管支架。

脱细胞血管基质在组织工程血管中的研究已经取得很大的进步，它因含有特殊氨基酸序列，具有促进细胞吸附或保留分化功能，并且富含生长因子及细胞黏附序列[3-4]，作为天然生物支架材料逐渐受到人们的重视。

本实验采用酶、低渗溶液和化学除垢剂相结合的方法制备兔主动脉脱细胞血管基质，
并将其保存于液氮中，3个月后取标本作扫描电镜观察，为进一步构造全生物化组织工程血管提供支架材料。

设计：随机分组，对比观察。

时间及地点：实验于2007-08/2008-05在青岛市市立医院心脏外科实验室完成。

材料：
实验动物：2月龄新西兰雄兔1只，体质量
1Department of Cardiovascular Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 2Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Chi Yi-fan☆, Doctor, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Cardiovascular Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province,**********************
Supported by: a grant by Science and Technology Bureau of Qingdao, No. 06-2-2-6-nsh＊
Accepted: 2010-09-09
1青岛大学医学院附属青岛市立医院心脏外科，山东省青岛市266071；2青岛大学医学院附属医院麻醉科，山东省青岛市 266071
池一凡☆，男，1964年生，福建省龙岩市人，汉族，2001年法国马赛第二大学医学院毕业，博士，主任医师，教授，硕士生导师，主要从事心血管外科的基础及临床研究。

*****************
修回日期：2010-09-09 (20100702008/M ·Y) 1.5 kg，由青岛市实验动物和动物
实验中心提供(SCXK(鲁)20010010)。

实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[5]。

实验试剂和仪器：
实验方法：
脱细胞血管基质的制备[6]：无菌条件获取兔胸主动脉，放入15 mL离心管中，处理过程如下：①加入含双抗的0.125%胰蛋白酶6~8 mL，作用4 h。

②磷酸盐缓冲液冲洗3次，无菌去离子水作用12 h。

③1%TritonX-100溶液作用24 h。

④磷酸盐缓冲液冲洗3次，无菌去离子水作用4 h。

⑤0.01%十二烷基硫酸钠作用24 h。

⑥磷酸盐缓冲液冲洗3次，含双抗的Hank’s液冲洗4 h后保存。

以上步骤均在37 ℃恒温振荡器中持续振荡。

光镜观察：获得的脱细胞血管基质用体积分数为10%甲醛固定，作苏木精-伊红染色，观察细胞脱除情况。

电镜观察：获得的脱细胞血管基质用2%戊二醛固定，扫描电镜、透射电镜观察细胞脱除情况及胶原纤维和弹性纤维情况。

保存：将脱细胞血管基质保存于液氮中，3个月后取出标本用2%戊二醛固定，扫描电镜观察，并与新鲜标本比较。

设计、实施、评估者：实验设计为第一作者，资料收集为第三作者，干预实施为第
二、三作者，评估为第六作者。

采用双盲法评估。

2.1 大体观察结果血管剥除外膜后，管壁弹性良好，管腔无塌陷，内膜面光滑完整。

脱细胞处理后，呈乳白色，管壁无破损，弹性良好，管腔无塌陷。

2.2 光镜观察结果新鲜血管苏木精-伊红染色石蜡切片可见血管壁中有大量核被蓝染的细胞存在，清晰可见胶原纤维亮红色，呈波浪状平行排列，见图1a。

脱细胞血管基质苏木精-伊红染色光镜观察，可见胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和
结构，呈波浪状排列，胶原纤维和弹性纤维无断裂，细胞已全部去除，见图1b，c。

2.3 扫描电镜、透射电镜观察结果脱细胞血管基质扫描电镜观察，可见基质的基
底膜面光滑完整，波浪状排列，无破裂，见图2a；弹性纤维结构完整，为网状排列，孔径(20~ 30) µm×(40~50) µm，见图2b。

透射电镜下可见胶原纤维横纹，纤维无断裂，见图2c。

2.4 液氮保存3个月后扫描电镜观察可见胶原纤维及弹性纤维结构完整，成网状
排列，胶原纤维及弹性纤维无断裂现象，与新鲜血管基质无明显差别，见图3a，b。

组织工程领域的一个重要难题是小口径组织工程血管的构建。

由于其特殊的低流体切应力环境容易引起血栓的形成，因此对构建小口径组织工程血管的材料有更高要求。

生物来源的材料具备更好的生物相容性而备受关注。

直接由细胞外基质蛋白通过交联作用形成的血管支架，由于纤维的排布无序导致力学性能变差，同时由于不能完全囊括天然血管胞外基质中的众多蛋白和多糖等成分，细胞的黏附力显著降低，完全由患者自身细胞组装的支架则需要长时间的体外成熟过程。

异体或异种血管，尤其是来源及其丰富的异种血管的开发和利用成为目前关注的焦点。

天然的异种血管经过脱细胞处理之后，得到的新型组织工程血管支架既能有效降低免疫原性，又能够抵抗受者体液环境的降解，同时又具备与受者血管相似的力学特征，被认为是除自体血管之外最有潜力的血管替代材料之一。

脱细胞血管基质是采用动物血管，经脱细胞处理后获得的一种生物材料，它不仅去除了血管原有的免疫原性，保持了血管的原有形态和物理性能，而且保存了细胞识别的结合位点，易于种子细胞的种植和吸附[7-9]。

目前，血管脱细胞组织基质已
应用于膀胱、骨、软骨等的重建[10-15]。

脱细胞的方法主要有物理方法、酶消化法和除垢剂法[16-17]。

物理方法主要有冷冻、加压、超声和搅拌等。

快速冷冻只是引起细胞破碎，必须有其他方法的辅助才
能除去细胞碎屑。

加压的方法也可用于细胞破碎，但仅限用于细胞外基质不是很致密的组织(如肝和肺)。

搅拌和超声往往与化学方法同时使用，它们可以加强细胞的破碎和去除。

超声的最佳强度和频率还未确定，但有研究表明标准的超声清洗仪在除去组织的细胞成分方面非常有效。

酶消化法脱细胞主要通过应用蛋白酶、钙离子鳌合剂、核酸酶来实现。

酶消化法仍然存在一些不足，除了脱细胞效果的不确定性之外，长时间用胰酶和EDTA处理的组织，其细胞外基质的结构也会被破坏，具体表现为弹性蛋白含量降低、黏多糖，尤其是磷酸化的黏多糖含量减少、层黏连蛋白和纤黏连蛋白的含量也显著减少。

酶消化法处理的过程中往往需要加入蛋白酶抑制剂，它能够抑制细胞释放的内源蛋白酶对细胞外基质的破坏作用。

除垢剂主要包括离子除垢剂和非离子除垢剂，离子去垢剂能够有效溶解细胞膜和核膜，但同时也会使蛋白质变性。

最常用的离子去垢剂有SDS、脱氧胆酸钠、Triton X-200等。

SDS比起其他脱细胞试剂，其脱细胞的效果更好，核残留和胞质蛋白的去除更彻底,有文献表明仅用0.03%SDS就能将心脏瓣膜中的细胞完全除去，且胞外基质保存完好[18]，而Rieder等[19]的研究表明使用0.1%SDS制备的脱细胞血管基质由于细胞毒性过大，细胞根本无法在上面存活。

非离子除垢剂在脱细胞过程中被广泛应用，因为它们对组织结构的影响较为温和。

非离子去垢剂能够破坏脂质与脂质之间、蛋白与脂质之间的联系，而蛋白与蛋白之间的连接保持完整，因此，非离子去垢剂处理的组织中，蛋白质能够维持具备功能的构象。

Triton X-100是最常用的非离子去垢剂，它能够在24 h内除去心瓣膜内的所有细胞成分，而瓣膜结构保持完整[20-22]。

应用低渗溶液(去离子水和低盐溶液)和高渗溶液分别处理组织，能够促进细胞溶解。

但是利用渗透压差处理组织并不能将破碎的细胞碎片去除，尤其是黏附在细胞外基质蛋白上的DNA残片更难去除。

因此，实验中采取酶、低渗溶液和化学除垢剂相联合的方法处理血管，先用胰酶对血管壁中的某些基质进行溶解和对细胞的完整性加以破坏，然后用低渗溶液进一步
导致细胞溶胀、破裂，最后加用化学除垢剂进一步去除细胞及细胞残片，达到彻底清除细胞，并最大程度减轻对胶原纤维及弹性纤维的损伤，并且制备的脱细胞血管基质具有以下优点：①合适的三维多孔且内部贯通的网络结构以适应细胞的生长、养分的输送和代谢产物的排放。

②良好的生物相容性和表面活性。

③良好的细胞亲和性，合适的表面化学以适合细胞附着，增殖和分化[23-24]。

④不引起机体的免
疫排斥反应。

⑤具有良好的可塑性和机械强度。

⑥材料来源广泛，易于快速加工[25]、灭菌、消毒等，并且采用液氮保存组织工程血管，可以为临床上争取充足的时间培养种子细胞及细胞种植联合培养，为构建组织工程血管并应用于临床提供材料。

来自本文课题的更多信息--
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。

课题的意义：课题将多种自体细胞与外周血内皮祖细胞联合种植用于全生物化组织工程血管的构建；并探索联合种植多种自体细胞与外周血内皮祖细胞后细胞之间及细胞与脱细胞血管基质之间的相互影响及相互关系。

课题评估的“金标准” ：组织工程血管的研究目前尚处于探索阶段，尚无评价的“金标准”。

设计或课题的偏倚与不足：实验中兔的大小和血管取材的部位可影响血管壁的厚度，进而影响脱细胞程度，因此实验中兔体质量为1.5 kg，取其胸主动脉，制备脱细
胞血管基质后采用随机分组，盲法评估，这就减少实验过程中的偏倚。

电镜的制作技术可能造成脱细胞血管基质的组织形态上的差异，在制作上严格按照要求进行，并且尽量包括管壁的全层，以减少组织形态上的偏倚。

提供临床借鉴的价值：实验使用液氮保存组织工程血管，可以有充足的时间培养种
子细胞和进行细胞种植联合培养，不受取材时间的限制，收治患者可随时择期手术，可以不考虑组织相容的问题及无伦理道德问题，为进一步构造全生物化组织工程血管提供经验。

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