植物基因组DNA提取及电泳分析 - 西北农林科技大学
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在碱变性条件下染色体dna的氢键断裂双螺旋解开而变性质粒dna氢键也大部分断裂双螺旋也有部分解开但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离当ph48的乙酸钠将其ph调到中性时变性的质粒dna又恢复到原来的构型而染色体dna不能复性形成缠绕的致密网状结构离心后由于浮力密度不同染色体dna与大分子rna蛋白质sds复合物等一起沉淀下来而被除去
带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼
脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。
实验六 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）
z 实验目的 z 学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增
目的基因的技术及操作。
z 实验原理 z 普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生
物的基因中大多包含内含子，所以从染色体DNA为模 板扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分 子，不能用于基因工程的直接表达。人工去除内含子 是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依 赖于RNA的DNA聚合酶，在oligo（dT）的引导下合 成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按 普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增 出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的 5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此 逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途 径。
z 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数 值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷 效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而 定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在 高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极 移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电 荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷 效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程 度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的 电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断
裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不 会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的 致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分 子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC
多核苷酸激酶
pCCGAATTCGG GGCTTAAGCCp
G
AATTC
CTTAA
G
粘性末端载 体
T4 连接酶 EcoR I
AATTC G
T4 连接酶
GAATTC CTTAAG
重组子
GAATTC CTTAAG
粘性末端连接
T4 连接酶
GAATTC CTTANA。
实验四 质粒DNA酶切
z 实验目的 z 学习质粒的酶切及电泳分析。
z 实验原理
z 限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特 异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA 片段再连接。
z 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就 能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳 凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移 率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对 分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗 略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
3， z ⑹两条引物间配对碱基数小于5个。 z 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计
算机来辅助设计。
实验十 质粒载体和外源DNA的连 接反应
实验目的 z 掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应
的注意事项。
实验原理
z DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现 的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的 DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来， 该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA 连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连 接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4 噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末 端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片 段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则 需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连 接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式 是目的片段之间能够匹配。
z 在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关 键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通 常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的 片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和 目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓 度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应 保持在25 --100 ng / μl。
z ⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基 序列互补的DNA链。
z 每一个循环的产物可作为下一个循环的模板， 通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达 106倍。
引物设计原则
z 要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进 行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：
z ⑴引物长度：15~25个核苷酸； z ⑵GC含量为40%~60%； z ⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算； z ⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%； z ⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于
实验八 植物基因组DNA 提取及电泳分析
实验目的
z 掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事 项。大分子量DNA分子的酶切分析。
实验原理
z 十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可 溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中 是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中 沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽 提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎 片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核 酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片， 下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
z 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具 有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色 体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、
煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快 速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的
z 连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行， 通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是 平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外， DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。
载体
DNA片段
EcoR I 酶切
G
AATTC
CTTAA
G
粘性末端载 体
AATTC G
G CTTAA
接头
平末端DNA片段
z PCR进行的基本条件： z ⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA） z ⑵引物 z ⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） z ⑷Taq DNA聚合酶 z ⑸反应缓冲体系
z PCR循环由三个步骤组成：
z ⑴变性 使模板DNA解离成单链；
z ⑵退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结 合；
实验三 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
z 实验目的 z 学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA
的构型，含量以及分子量的大小。
z 实验原理 z 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方
法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。其原理 是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品 在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入 DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光， 增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将 已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可 比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接 在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从 照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng 的DNA。
实验五 RNA提取与纯化
z 实验目的 z 掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程
中的各种注意事项。
z 实验原理 z RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。 z RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核
酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞， 然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加 入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区 分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同， DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在 0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用 它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量 一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合 体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的 溶解性。
操作过程中应戴手套。
z
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性
（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的
A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，
未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条
带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条
分子生物学实验技术
西北农林科技大学生命学院生物技术系
实验一 细菌的培养
z 实验目的 z 学习细菌的培养方法及培养基的配置。
z 实验原理 z 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺
少杆菌。 z 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细 胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素 的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基 中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后 进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增 殖。 z 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。 实验室中最常用的是LB培养基。
GAATTC CTTAAG
人工接头连接
实验十一 感受态细胞的制备、转 化与鉴定
z 由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可 被除去。然后用紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳进行分 析。检查DNA分子的完整性。
实验九 聚合酶链反应（PCR）技 术体外扩增DNA
z 实验目的 z 1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。 z 2、了解引物设计的一般要求。
实验原理
z 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术 可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用 于基因工程操作。
实验二 质粒DNA的提取
z 实验目的 z 学习碱裂解法提取质粒的原理
z 实验原理
z 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双 链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能 力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可 表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的 质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工 具——载体。
z 进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常 要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶 完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将 载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行 连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强 目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸 在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸 化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段 和载体的连接。
z RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。 所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃烘烤6小时以上。所有的塑料 器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备 用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关 的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外
实验七 感受态细胞的制备
z 实验目的 z 掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
z 实验原理
z 所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞， 使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通 常用0.1M CaCl2处理细胞，就可得到感受态 细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态 细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方 法有多种，入热休克法，电击法等。通过这些 方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。
带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼
脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。
实验六 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）
z 实验目的 z 学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增
目的基因的技术及操作。
z 实验原理 z 普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生
物的基因中大多包含内含子，所以从染色体DNA为模 板扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分 子，不能用于基因工程的直接表达。人工去除内含子 是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依 赖于RNA的DNA聚合酶，在oligo（dT）的引导下合 成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按 普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增 出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的 5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此 逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途 径。
z 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数 值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷 效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而 定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在 高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极 移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电 荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷 效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程 度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的 电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。
变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断
裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不 会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的 致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分 子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
CCGAATTCGG GGCTTAAGCC
多核苷酸激酶
pCCGAATTCGG GGCTTAAGCCp
G
AATTC
CTTAA
G
粘性末端载 体
T4 连接酶 EcoR I
AATTC G
T4 连接酶
GAATTC CTTAAG
重组子
GAATTC CTTAAG
粘性末端连接
T4 连接酶
GAATTC CTTANA。
实验四 质粒DNA酶切
z 实验目的 z 学习质粒的酶切及电泳分析。
z 实验原理
z 限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特 异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA 片段再连接。
z 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就 能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳 凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移 率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对 分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗 略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
3， z ⑹两条引物间配对碱基数小于5个。 z 由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计
算机来辅助设计。
实验十 质粒载体和外源DNA的连 接反应
实验目的 z 掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应
的注意事项。
实验原理
z DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现 的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的 DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来， 该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA 连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连 接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4 噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末 端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片 段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则 需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连 接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式 是目的片段之间能够匹配。
z 在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关 键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通 常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的 片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和 目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓 度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应 保持在25 --100 ng / μl。
z ⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基 序列互补的DNA链。
z 每一个循环的产物可作为下一个循环的模板， 通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达 106倍。
引物设计原则
z 要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进 行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：
z ⑴引物长度：15~25个核苷酸； z ⑵GC含量为40%~60%； z ⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算； z ⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%； z ⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于
实验八 植物基因组DNA 提取及电泳分析
实验目的
z 掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事 项。大分子量DNA分子的酶切分析。
实验原理
z 十六烷基三乙基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可 溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中 是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中 沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽 提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎 片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核 酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片， 下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。
z 质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具 有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色 体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、
煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快 速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的
z 连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行， 通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是 平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外， DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。
载体
DNA片段
EcoR I 酶切
G
AATTC
CTTAA
G
粘性末端载 体
AATTC G
G CTTAA
接头
平末端DNA片段
z PCR进行的基本条件： z ⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA） z ⑵引物 z ⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） z ⑷Taq DNA聚合酶 z ⑸反应缓冲体系
z PCR循环由三个步骤组成：
z ⑴变性 使模板DNA解离成单链；
z ⑵退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结 合；
实验三 琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
z 实验目的 z 学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA
的构型，含量以及分子量的大小。
z 实验原理 z 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方
法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。其原理 是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品 在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入 DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光， 增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将 已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可 比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接 在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从 照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng 的DNA。
实验五 RNA提取与纯化
z 实验目的 z 掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程
中的各种注意事项。
z 实验原理 z RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。 z RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核
酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞， 然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加 入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区 分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同， DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在 0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用 它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量 一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合 体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的 溶解性。
操作过程中应戴手套。
z
判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性
（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的
A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，
未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条
带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条
分子生物学实验技术
西北农林科技大学生命学院生物技术系
实验一 细菌的培养
z 实验目的 z 学习细菌的培养方法及培养基的配置。
z 实验原理 z 在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺
少杆菌。 z 大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细 胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素 的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基 中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后 进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增 殖。 z 培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。 实验室中最常用的是LB培养基。
GAATTC CTTAAG
人工接头连接
实验十一 感受态细胞的制备、转 化与鉴定
z 由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可 被除去。然后用紫外吸收法和琼脂糖凝胶电泳进行分 析。检查DNA分子的完整性。
实验九 聚合酶链反应（PCR）技 术体外扩增DNA
z 实验目的 z 1、学习PCR反应的基本原理和实验技术。 z 2、了解引物设计的一般要求。
实验原理
z 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术 可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用 于基因工程操作。
实验二 质粒DNA的提取
z 实验目的 z 学习碱裂解法提取质粒的原理
z 实验原理
z 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双 链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能 力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可 表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的 质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工 具——载体。
z 进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常 要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶 完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将 载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行 连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强 目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸 在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸 化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段 和载体的连接。
z RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。 所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃烘烤6小时以上。所有的塑料 器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备 用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关 的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外
实验七 感受态细胞的制备
z 实验目的 z 掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
z 实验原理
z 所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞， 使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通 常用0.1M CaCl2处理细胞，就可得到感受态 细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态 细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方 法有多种，入热休克法，电击法等。通过这些 方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。