第9章 基因文库

N = ln (1- P)/ln (1- f)组的比例

如果E. coli 随机片段的大小为 20 kb, 要求含有各 序列的概率为 0.99, 其基因库的克隆数应为: N = ln(1-0.99)/ln(1- 2×104/4.6×106) = 11000.99)/ln(1- 2×104/3×109) = 690000 减少所需克隆数的方法是增加克隆片段的长度.


因此, 应根据起始基因组的大小, 选容量合适的基因载 体. 即大的基因组应选用容量较大的基因载体,如 BACs和YACs; 小的基因组可选用容量较小的基因 载体, 如质粒、噬菌体载体、C取
组织细胞 →研磨萃取 →分离基因组DNA →DNA纯化
DDRT-PCR
mRNA →→→ ds cDNA ├ random primer and ↓ poly(A)10-12NN 反转录 ↓ PCR ↓ 电泳及电泳图谱成像 ↓ 寻找差异cDNA带→设计探针 ↓ 分子杂交筛查DNA克隆
2.2 消减杂交
* 以两个表型差异明显的个体提取两个基因组 DNA样品(或突变型与野生型)进行限制酶切 * 两个DNA样品的 ssDNA片段除了个别差异, 绝大多数可以互补配对. * 只有差异的片段或基因片段才必须与原样品 的互补单链配对. * 通过载体连接将差异片段(互补配对后产生 粘性末端)形成重组体DNA. * 扩增差异DNA片段设计探针可筛查出含有 特异基因DNA克细胞在特定 时期的基A片段或靶基因的特定DNA克隆. • 靶DNA克隆可用DNA探针通过分子选. • 其他方法还包括：表达筛查、菌落或噬菌斑杂 交和染色体步移等.
2 表型克隆筛选

表型克隆策略不依赖于基因的序列信息，只比较 突变型DNA与野生型DNA的差异，直接对变异的 DNA进行分离。它的特点是从表型差异入手，克 隆突变基因相关的DNA。

表型克隆研究的主要技术方法有：
差异显示反转录PCR (differential-display RT-PCR DDRT-PCR)、 消减杂交(subtractive hybridization，SH) 抑制性消减杂交 (suppression subtractive hybridization，SSH)等。
• 重组体DNA制备与转化 基因组DNA ─┳→ 随机片段 ─┬→ 重组体DNA 限制性内切酶┛ 基因载体┛ ↓ 转化 ↓ 细胞培养(液体) ↓ 基因组←平板培养基因组DNA
酶切DNA
隆的

基因组DNA 随机片段公式表示:第九章 基因第一节第二节 第三节
基因组cDNA 基因筛查将某种生物细胞的基因组或染色体DNA的所有限制 酶切片断(或机械剪切片段)随机地连接到基因载体 上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖 而构成含各个随机片段的一系列无性繁殖系 (DNA 克隆)，当DNA克隆数目足以包括该种生物的全部 基因时，这些克隆的总体就称为该种生物的基因文 库. 每一DNA克隆内所包含的靶DNA片段既可能是一个 或几个基因，也可能是一个基因的一部分, 或完整 基因及其 是序列信息的总和.
DNA first strand (cDNA-mRNA)
cDNA-mRNA ─→ ss cDNA ━━→ ds cDNA
H 酶活性 DNA聚合酶活性 纯化cDNA样品 带有一个限制性内切酶 的识别序列)的连接; 限制酶分别切割cDNA与载体DNA分子; 载体与cDNA连接构建重组体DNA分子; 重组体DNA转化宿主细胞与转化细胞培养; 平板培养与各个cDN
磁珠分离法
Poly (T)
摇晃振荡
mRNA
磁珠
磁铁 tRNA rRNA
磁珠
总RNA
纯化的mRNA
通过寡聚T-纤维素的mRNA分离纯化
Poly (T)
总RNA 洗脱 mRNA 吸附mRNA
寡聚T-纤维素
tRNA rRNA mRNA
2 cDNA合成
mRNA
反片段的集合体, 每 个片段被分别构建成是在DNA的分离提取及克隆操作过程中不生的一个随有时空特性, 即特定组 织细胞在特定生长发育阶育时期或特定环境条件下的总 mRNA也称为转录组(transcril DNA sample
（对照）
（待测）
Random shearing
Driver DNA Mutant DNA sample Restriction digest Target DNA
200∶1
探针
克隆筛选
3 DNA克隆分析
寻找出目标DNA克隆之后，对其分析主要在以下几 个方面进行： 测序(双向测序)，确定阅读框(ORF)和限制酶位点; 推导出所表达蛋白质的氨基酸序列, 利用数据库进 行蛋白质三维结构模拟, 功能分析; 不同物种同源序列比对, 亲缘关系分析; 亚克隆和再转化, 基因表达分析; 定点诱变及氨基酸功能分析; 基因组织结构分析：确定内含子、外显子、基因间 的间隔区、上游启动子。
2.1 DDRT-PCR 两个有表型差异的同种生物必然存在着某些 基因转录水平的差异; 转录水平的差异导致mRNA在质(种类)和量 上的差异; 通过反转录和PCR可将其间的差异扩大而易 被检测出来； 有差异的cDNA带可能与性状变异相关； 根据差异cDNA带设计探针可用于筛查含有 相关基因的克隆。
DNA探针杂交
各DNA克隆的 DNA样品 含标记探针 的缓冲液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
NC膜
靶DNA 克隆
菌落杂交或噬菌斑杂交
NC膜转移
平板培养
查出所需 DNA克隆
碱变性烤膜
探针杂交 显示标记
染色体移步
从 S 基因开始查找 O 基因 染色T, STU 以QRS为探针筛查: OPQ, PQR, QRS, RST, STU 以PQR为探针筛查: NOP, OPQ, PQR, QRS, RST 以OPQ为探针筛查: MNO, NOP, OPQ, PQR, QRS 从OPQ再克隆 O基因或DNA片段