HPLC-MS法测定大鼠血浆中广藿香酮衍生物PPCl浓度及其药动学研究

HPLC-MS法测定大鼠血浆中广藿香酮衍生物PPCl浓度及其
药动学研究
张岚;彭成;程芳;陈婕妤;潘媛;韩波;张若琪
【摘要】目的建立大鼠血浆中广藿香酮衍生物(PPCl)浓度的HPLC-MS分析方法,并研究该药在大鼠体内的药动学特征.方法采用乙酸乙酯萃取大鼠血浆中的药物和内标(大黄素),以Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18(3mm×100mm,2.7μm)为色谱柱;以乙腈-水(5mmol/L醋酸铵)为流动相梯度洗脱,流速为0.3mL/min;质谱采用ESI离子源和负离子多重反应离子监测方式测定大鼠血浆中PPC1的浓度.结果大鼠血浆中的PPCl在33.26～30800ng/mL线性范围内线性关系良好(r=0.997);批内、批间精密度和准确度符合生物样品的检测要求;提取回收率和基质效应的平均值分别为99.83％和94.40％;大鼠灌胃给予10mg/kg的PPC1,药物的t1/2为(14.57±1.93)h,Cma x为(19.29±6.47)μg/mL,AUC0～t为
(434.40±140.09)μg/(mL.h),结论本实验建立的测定大鼠血浆中PPCl的HPLC-MS法,操作简单,灵敏度高,专属性强,无内源性及其他杂质干扰,适用于大鼠血浆中PPC1浓度的测定及其药动学研究.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2019(044)005
【总页数】4页(P632-635)
【关键词】广藿香酮衍生物;药动学;HPLC-MS法
【作者】张岚;彭成;程芳;陈婕妤;潘媛;韩波;张若琪
【作者单位】成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137;成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137;成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137;成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137;成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137;成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137;成都中医药大学药学院,中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培养基地,成都611137【正文语种】中文
【中图分类】R9
广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin[(Blanco) Benth]的地上干燥部分[1]，广藿香酮为其主要有效成分之一。

本实验室前期就广藿香酮的药理活性以及药动学进行了研究，发现其具有显著的抗真菌活性和良好的生物利用度[2-4]。

但由于广藿香酮侧链处于一个较大的疏水空腔，致使其与抗菌关键作用靶点为四硝季戊四醇还原酶结合不紧密，影响其抗菌效应。

为改善其抗菌活性，提高药物与靶点的结合能力，本实验室在广藿香酮的侧链引入大位阻的疏水官能团，合成一系列广藿香酮衍生物，其中广藿香酮衍生物PPCl抗菌作用显著，具有较大的开发前景[5]。

广藿香酮衍生物PPCl为3(2E,4E)-5-(4-氯代苯基)戊-2,4-烯酰基)-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮 (3(2E,4E)-5-(4- chlorophenyl) penta-2, 4-dienoyl)-4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one)，是本实验室以脱氢乙酸和有机醛为原料，利用
Alodl加成反应，二苯基脯氨醇三甲基硅醚为催化剂合成，其结构如图1所示。

前期研究表明PPCl具有良好的抗菌活性，对革兰阳性菌的抑制活性较强，尤其对金黄色葡萄球菌效果明显，MIC值为4μg/mL。

其抗菌机制可能是通过破坏细菌DNA结构、抑制胞内酶活性、抑制细菌核酸、蛋白质和ATP等[5-7]。

由此可见，PPCl抗菌效果佳，具有良好的开发前景，本实验通过研究该药物的药动学参数，
为PPCl进一步研究和开发奠定基础。

1 实验材料
1.1 实验药物和试剂
广藿香酮衍生物PPCl(纯度≥95%，由成都中医药大学药学院韩波教授提供)；大黄素对照品(纯度≥98%，批号为150422，成都克洛玛生物科技有限公司)；乙腈(色谱级，美国Fisher公司)、甲醇(色谱级，美国Fisher公司)、醋酸铵(色谱级，美国Fisher公司)、水(色谱级，美国Fisher公司)、乙酸乙酯(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。

1.2 实验仪器
图1 广藿香酮衍生物(PPCl)结构图Fig.1 Structural of pogostone derivative (PPCl)
高效液相色谱仪(Agilent1260型号，包括四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器)，三重四级杆液质联用仪(Agilent 6410C，包括ESI电离源，Mass Hunter工作站
软件系统)；电子分析天平(型号BP-211D，德国Sartorius公司)；涡旋振荡器(型号：2E-179277，美国Vortex-Genie公司)；Allegra X-30系列离心机(型号：ALZ138033，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)；氮气吹扫仪(型号：MD200，
杭州奥盛仪器有限公司)；超声清洗波器(型号：KQ-5200E，昆山市超声仪器有限
公司)。

1.3 实验动物
SD大鼠8只(SPF级，雌雄各半)，体重200～220g，成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SYXK(川)2015-030。

2 实验方法与结果
2.1 色谱和质谱条件
色谱柱：InfinityLab Poroshell 120 ECC18(3mm×100mm, 2.7μm)；保护柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(3mm×5mm, 2.7μm)；流动相A为
5mmol/L醋酸铵水，流动相B为乙腈；梯度洗脱：0～1min：55%乙腈，1～
3min：55%～80%，乙腈，3～8min：80%乙腈；流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：5μL。

离子源：ESI，负离子模式，以氮气做干燥气，流速：12L/min，脱溶剂温度：300℃，雾化室压力：45.0psi，毛细管电压：4000V，碰撞能量：11V，碎裂电压：90V，扫描方式：多重反应监测模式(MRM)。

PPCl和大黄素的检测离子分别为：
m/z 315→231和m/z 268.9→239.8，268.9→224.9。

2.2 溶液的配制
精密称取适量广藿香酮PPCl对照品和大黄素对照品，用甲醇分别稀释溶解定容成浓度为308μg/mL的PPCl贮备液和190μg/mL的大黄素贮备液；用甲醇分别稀
释PPCl贮备液和大黄素贮备液，依次配制成：30800、23100、15400、9240、4620、1386、415.8、83.16和33.26ng/mL的PPCl标准工作溶液和浓度为3800ng/mL的内标溶液。

2.3 血浆样品处理方法
分别取50μL内标溶液和50μL PPCl标准工作溶液加入到50μL空白血浆中，混匀后加入1.3mL乙酸乙酯，涡旋混匀3min后，离心(12000r/min，4℃，10min)，取上清液，常温下氮气吹干，用流动相复溶后，涡旋1min，超声10s后离心(12000r/min，4℃，10min)，取上清液进行分析，进样量：5μL。

2.4 方法和结果
2.4.1 专属性考察
按“2.3”项方法操作，分别制备空白血浆样品、加入PPCl工作溶液和大黄素溶液的血浆样品以及大鼠灌胃给药后的血浆样品，得到色谱图A～C。

结果表明PPCl和大黄素的出峰时间分别为6.3min和4.8min，二者分离性良好，血浆中的杂质不影响样品的测定，专属性良好，结果如图2所示。

2.4.2 标准曲线和定量下限
按“2.3”项方法操作，于空白血浆中分别精密加入PPCl工作液和内标溶液，配成浓度为30800、23100、15400、9240、4620、1386、415.8、83.16和33.26ng/mL的血浆样品，内标的血浆浓度为3800ng/mL。

以“2.1”项色谱质谱方法测定PPCl的浓度，以PPCl的浓度为横坐标，PPCl与大黄素峰面积的比值为纵坐标做回归运算，得到标准曲线：y=0.0011x+0.0184，r=0.997(权重
=1/W1.5)。

PPCl在33.26～30800ng/mL范围内线性关系良好，定量下限为33.26ng/mL。

图2 PPCl和内标在大鼠血浆中的MRM色谱图Fig.2 The MRM chromatograms of PPCl and IS in rat plasmaA：空白血浆；B：空白血浆中加入PPCl和大黄素；C：大鼠灌胃给药后血浆样品
2.4.3 精密度与准确度
按“2.3”项方法操作，在空白血浆中加入浓度为33.26、83.16、4620和23100ng/mL的工作溶液，制备质控样本，每个浓度做6个样本。

连续测定3个分析批，计算该方法的日内和日间精密度和准确度，结果见表1。

结果表明此方法下PPCl的日内、日间精密度和准确度均符合《药物非临床药代动力学研究技术指导原则要求》。

表1 PPCl大鼠血浆样品的精密度和准确度Tab.1 Precision and accuracy for
PPCl in rat plasma浓度/(ng/mL)准确度(RE)/%32.26 7.89 97.57±7.93 10.21 95.52±4.09 83.16 3.92 108.20±4.19 10.13 109.71±4.02 4620 3.18
108.63±3.42 4.98 107.78±1.18 23100 2.73 98.93±2.47 3.90 98.98±2.02批内(n=6) 批间(n=3)精密度(RSD)/%准确度(RE)/%精密度(RSD)/%
2.4.4 提取回收率
按“2.3”项方法操作，分别制备83.16、4620和23100ng/mL 3个浓度的血浆样品，每个浓度5个样本，按照“2.1”项色谱质谱条件下测得PPCl和大黄素的峰面积之比，记为A1；另取空白血浆按照“2.3项处理后，取上清液，加入质量浓度分别为83.16、4620和23100ng/mL的PPCl工作溶液和浓度为
3800ng/mL大黄素溶液，每个样品5个浓度，常温下氮气吹干，流动相复溶，涡旋1min，超声10s后离心(12000r/min,4℃, 10min)，取上清液进行分析，得到药物和内标的峰面积之比，记为A2；回收率=A1/A2×100%(表2)。

2.4.5 基质效应
于空白Ep管中，分别加入浓度为83.16、4620和23100ng/mL浓度的PPCl的工作溶液和30800ng/mL的大黄素内标溶液，每个浓度5个样本，常温下氮气吹干，流动相复溶，涡旋1min，超声10s后离心(12000r/min, 4℃, 10min)，取上清液按照“2.1”项色谱质谱条件测定PPCl与内标的峰面积之比，记为A3；基质效应=A2/A3×100%，结果表明基质对样品的测定无明显影响(表2)。

2.4.6 稳定性考察
按“2.3”项方法操作，分别考察83.16、4620和23100ng/mL 3个浓度的血浆样本于室温下放置12h、经处理后的血浆样本在自动进样器中放置24h(室温)、经3次冻存复溶的稳定性以及在-20℃环境下冰冻放置30d后的稳定性，每个浓度5个样本，结果如表3。

表2 PPCl大鼠血浆样品回收率和基质效应(n=5)Tab.2 Extraction recovery and
matrix effect of PPCl in rat plasma (n=5)浓度/(ng/mL) 提取回收率/% 基质效
应/%83.16 101.34±8.31 91.08±7.11 4620 101.92±10.64 96.32±10.66 23100 96.24±11.57 95.79±1.17
表3 PPCl大鼠血浆样品的稳定性(n=5)Tab.3 The stability of PPCl in rat plasma (n=5)注：偏差=(真实值-稳定性样品测定浓度平均值)/真实值×100浓度
/(ng/mL)-20℃长期冻存放置30d 83.16 13.45 -0.89 13.82 8.33 4620 8.95 -
7.21 8.52 9.50 23100 12.72 2.86 13.59 12.43偏差/%室温下放置12h进样器中放置24h-20℃冻存复溶3次
2.5 方法应用和结果
2.5.1 实验动物和样品处理
选取8只SD大鼠(雌雄各半)单剂量灌胃给予10mg/kg的PPCl，于给药前及给药后0.5、1、3、5、8、10、12 、17、24、36、48和72h眼眶取血0.3mL，置于肝素化离心管中，离心(3500 r/min, 4℃,15min)，取上清液血浆，贮藏于-20℃待用。

2.5.2 药动学参数的计算
按“2.3”项方法处理后，以“2.1”项色谱质谱条件检测PPCl的浓度，应用软件：Phoenix WinNonlin 6.3，以非房室模型处理所得数据，得出相关的药动学参数。

结果如表4，平均药-时曲线如图3。

3 实验讨论
本研究采用HPLC-MS法对PPCl在SD大鼠血浆中的浓度进行了测定，以与PPCl 结构相似的大黄素作为内标，利用乙酸乙酯萃取的方法处理血浆样品，方法专属性高，无内源性杂质影响。

其次，在流动相中加入醋酸铵盐，增强药物的离子响应，改善待测物的峰型，提高灵敏度，最低可测浓度达到3ng/mL。

本实验采用梯度洗脱程序，提高水相比例，让极性大的内源性物质先出峰，避免杂质影响药物的响应，
降低基质效应[8]，提高方法的稳定性。

本实验通过对PPCl在大鼠体内药动学研究，首次获得了相应的药动学参数。

该药物的半衰期为(14.57±1.93)h，半衰期较长，在体内的滞留时间长，消除缓慢，可能与药物的吸收或者血浆蛋白结合率有关。

本实验建立的测定大鼠血浆中PPCl的HPLCMS法，能够满足PPCl药动学的研究，得到的药动学数据为PPCl进一步的研究与开发提供科学依据。

表4 大鼠灌胃给予PPCl的主要药动学参数(x±s , n=8)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of PPCl in rats plasma after intragastric administration of
10mg/kg PPCl (x±s , n=8)参数结果t1/2 /h 14.57±1.93 AUC0～t
/[μg/(mL·h)]434.40±140.00 AUC0～t /[μg/(mL·h)]451.02±150.21 MRT0～t /h 19.12±1.33 MRT0～∞ /h 21.72±1.69 Cmax/(μg/mL) 19.29±6.47 Tmax/h 8.00±2.33 Vd(L/kg) 0.50±1.40 CL[mL/(h.kg)]0.024±0.006
图3 PPCl按10mg/kg灌胃给药后大鼠平均药-时曲线(n=8)Fig.3 Mean plasma concentration-time profiles of PPCl in rats plasma after intragastric administration of 10mg/kg PPCl(n=8)
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