猪低背膘厚基因组及分子标记方法及其育种应用与设计方案

图片简介:
本技术介绍了一种与猪背膘厚性状相关的基因组和分子标记方法及其育种应用，其特征在于所述基因序列Seq ID No：4为存在于猪线粒体基因组D Loop区的单倍型H4的核苷酸序列分子，利用分子标记方法来标记和确定的具有所述单倍型H4的猪进行育种，本技术的有益效果是：创造性地发现猪线粒体基因D Loop区单倍型H4的6月龄母猪背膘厚极显著低于其它单倍型，即单倍型H4与低猪背膘厚性状相关，并通过检测猪线粒体基因组D Loop区的单倍型H4作为与猪低背膘厚相关联的分子育种标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

技术要求
1.一种猪低背膘厚基因组，其特征在于所述基因组的核苷酸序列为Seq ID No：4所示序列，该序列与猪低背膘厚性状相关。

2.根据权利要求1所述的基因组，其特征在于：所述的基因序列Seq ID No：4为存在于猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的基因组，其特征在于：存在于猪线粒体基因组D-Loop区的所述单倍型H4的核苷酸序列Seq ID No：4所示序列与猪低背膘厚性状相关。

4.一种利用猪低背膘厚基因组进行分子标记的方法，其特征在于与低猪背膘厚性状相关的基因组的序列为权利要求1-3任意一项所述的Seq ID No：4所示序列，所述基因序列为存在于猪线粒体基因组D-Loop 区的单倍型H4的核苷酸序列，具体的标记方法为：
(1)猪基因组DNA的获得；
(2)以步骤(1)的猪基因组DNA为模板，扩增线粒体基因组D-Loop区序列；
(3)鉴定线粒体基因组D-Loop区的单倍型；
所述线粒体基因组D-Loop区的单倍型是以Seq ID No：1(DLOOPF)和Seq ID No：2(DLOOPR)所示的特异性引物PCR扩增所得到的Seq ID No：3所示序列；
(4)检测并筛选在线粒体基因组D-Loop区为单倍型H4的猪，所述单倍型H4的基因序列为Seq ID No：4所示序列。

5.根据权利要求4所述的分子标记方法，其特征在于所述引物DLOOP中：
DLOOPF的序列Seq ID No：1为：5′-CAGCACCCAAAGCTGAAAT-3′；
DLOOPR的序列Seq ID No：2为：5′-ATGGAGCTGTGAGGCTCATCTA-3′。

6.一种分子标记辅助育种的方法，其特征在于利用权利要求4或5所述的分子标记方法来标记和确定的具有单倍型H4的猪进行育种。

技术说明书
一种猪低背膘厚基因组及分子标记方法及其育种应用
技术领域：
本技术属于分子遗传学及育种技术领域，更具体地涉及与猪背膘厚性状相关的线粒体基因组和多态位点分子标记方法及其育种应用。

背景技术：
我国是一个养猪大国，猪肉产量和质量的市场需求日益增加，提高猪肉产量、改善猪肉胴体质量，成为育种科学家长期以来不断探索的工作。

早期的育种工作主要集中于猪的表型选择，随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发，分子选择正逐渐成为可靠而有效的选择方法。

背膘厚是猪重要的经济性状，受到遗传和环境因素的共同影响。

其中，脂肪沉积是影响猪背膘厚性状的关键因素。

因此，背膘厚一直是猪育种目标的重要组成部分，背膘的厚薄不仅与瘦肉率有关，对于生长速度的影响也很巨大，因此其育种价值很高。

但是，由于背膘厚等指标只能在动物长成之后才能测定，一方面加大了育种成本，另一方面拉长了世代间隔，遗传进展缓慢。

分子生物技术的飞速发展和猪遗传连锁图谱的构建，为背膘厚等数量性状开展育种更准确、进展更快速的分子育种提供了研究基础。

另一方面，由于猪是人类研究的一种重要的模式动物，因此，找到猪对背膘有影响的基因有可能对人类的肥胖的研究提供一定的借鉴意义。

全基因组关联分析是畜禽经济性状遗传改良和机理解析的重要方法。

随着二代测序技术的发展，全基因组重测序和简化基因组测序技术成为高通量SNP分型的有力工具，可以从群体中直接鉴定SNP并进行分型，能以较低的成本获得几万到几十万不等的SNP分型信息，已被广泛应用于动植物的分子标记开发、群体遗传分析、全基因组关联分析以及基因组选择育种等研究中。

技术内容：
基于上述的原因，本技术通过筛选出猪低背膘厚的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪低背膘厚品种的培育提供基因标记和技术方法。

具体技术方案为：包括猪低背膘厚基因组，其特征在于所述基因组的核苷酸序列为Seq ID No：4所示序列，该序列与猪低背膘厚性状相关。

所述的基因序列Seq ID No：4为存在于猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4的核苷酸序列。

所述的基因组，存在于猪线粒体基因组D-Loop区的所述单倍型H4的核苷酸序列Seq ID No：4所示序列与猪低背膘厚性状相关。

一种利用猪低背膘厚基因组进行分子标记的方法，与低猪背膘厚性状相关的基因组的序列为所述的Seq ID No：4所示序列，所述基因序列为存在于猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4的核苷酸序列，具体的标记方法为：
(1)猪基因组DNA的获得；
(2)以步骤(1)的猪基因组DNA为模板，扩增线粒体基因组D-Loop区序列；
(3)鉴定线粒体基因组D-Loop区的单倍型；
所述线粒体基因组D-Loop区的单倍型是以Seq ID No：1(DLOOPF)和Seq ID No：2(DLOOPR)所示的特异性引物PCR扩增所得到的Seq ID No：3所示序列；
(4)检测并筛选在线粒体基因组D-Loop区为单倍型H4的猪，所述单倍型H4的基因序列为Seq ID No：4所示序列。

所述引物DLOOP中：
DLOOPF的序列Seq ID No：1为：5′-CAGCACCCAAAGCTGAAAT-3′；
DLOOPR的序列Seq ID No：2为：5′-ATGGAGCTGTGAGGCTCATCTA-3′。

一种分子标记辅助育种的方法，利用所述的分子标记方法来标记和确定的具有所述单倍型H4的猪进行育种。

本技术的有益效果是：
创造性地发现猪线粒体基因D-Loop区单倍型H4的6月龄母猪背膘厚极显著低于其它单倍型，即单倍型H4与低猪背膘厚性状相关，并通过检测猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4作为与猪低背膘厚相关联的分子育种标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

附图说明：
图1为基因组提取结果；
图2为DLOOPF和DLOOPR引物PCR扩增猪线粒体基因组D-Loop区电泳图；
图3为单倍型聚类分析；
表1为猪线粒体基因组D-Loop区多态位点；
表2为单倍型群与猪背膘厚关联分析；
表3为单倍型与猪背膘厚关联分析。

具体实施方式：
在本技术的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本技术的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本技术的实施并不限于这些细节。

另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本技术实施例的要点。

对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本技术中的具体含义。

本技术的具体实施方式：猪低背膘厚基因组，其特征在于所述基因组的核苷酸序列为Seq ID No：4所示序列，该序列与猪低背膘厚性状相关。

所述的基因序列Seq ID No：4为存在于猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4的核苷酸序列。

所述的基因组，存在于猪线粒体基因组D-Loop区的所述单倍型H4的核苷酸序列Seq ID No：4所示序列与猪低背膘厚性状相关。

一种利用猪低背膘厚基因组进行分子标记的方法，与低猪背膘厚性状相关的基因组的序列为所述的Seq ID No：4所示序列，所述基因序列为存在于猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4的核苷酸序列，具体的标记方法为：
(1)猪基因组DNA的获得；
(2)以步骤(1)的猪基因组DNA为模板，扩增线粒体基因组D-Loop区序列；
(3)鉴定线粒体基因组D-Loop区的单倍型；
所述线粒体基因组D-Loop区的单倍型是以Seq ID No：1(DLOOPF)和Seq ID No：2(DLOOPR)所示的特异性引物PCR扩增所得到的Seq ID No：3所示序列；
(4)检测并筛选在线粒体基因组D-Loop区为单倍型H4的猪，所述单倍型H4的基因序列为Seq ID No：4所示序列。

所述引物DLOOP中：
DLOOPF的序列Seq ID No：1为：5′-CAGCACCCAAAGCTGAAAT-3′；
DLOOPR的序列Seq ID No：2为：5′-ATGGAGCTGTGAGGCTCATCTA-3′。

一种分子标记辅助育种的方法，利用所述的分子标记方法来标记和确定的具有所述单倍型H4的猪进行育种。

为了更加直观的展现本技术的优势，具体地，上述实施方式的包括如下步骤：
(1)猪背膘厚性状的获得；
(2)猪基因组DNA的获得；
(3)分别以上述猪基因组DNA为模板，扩增线粒体基因组D-Loop区序列；
(4)鉴定线粒体基因组D-Loop区多态性、单倍型和单倍型群；
(5)分析单倍型、单倍型群与猪背膘厚的关联性；
(6)标记辅助育种。

通过关联分析发现线粒体D-Loop区单倍型H4猪的背膘厚性状显著低于其它单倍型，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

其中：上述实施过程包括：
(1)猪背膘厚性状的获得：猪背膘厚的测定
选择在同一猪舍、相同饲养条件下的长大二元杂交母猪为检测对象，所检测的母猪均在6月龄左右，身体健康，体型相似。

将待测定的猪只固定于限位栏内，在倒数3、4肋骨间距离背中线5cm处，剪去测定位置的猪毛，涂上适量耦合剂。

在活体背膘仪的探头位置涂抹适量耦合剂后，将探头紧贴测量部位，垂直于背部，轻轻旋动，无缝贴合后启动背膘仪开始测定，读取、记录猪只背膘厚信息。

(2)猪基因组DNA的获得及猪线粒体D-Loop区序列的扩增
基因组提取：采集猪的耳组织，按照艾德莱公司组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒的说明书进行基因组DNA提取，将基因组点样于1％TAE琼脂糖凝胶中,电泳结果如图1所示。

根据线粒体基因组序列(NCBI Reference Sequence:NC_000845.1)设计如下引物DLOOPF基因序列如Seq ID No:1所示，DLOOPR基因序列如Seq ID No:2所示，它包含了猪线粒体D-Loop区的全部序列(序列如Seq ID No:3所示)。

利用DLOOPF和DLOOPR引物扩增线粒体D-Loop区，扩增体系为2×A9LongHiFi PCRMasterMix(艾德莱公司)25μL，引物(10μM)各1μL，基因组DNA 1μL，加ddH2O至总体积50μL。

PCR反应条件为95℃3min；35个循环(95℃10s，56℃15s，72℃1min30s)；72℃5min。

得到PCR产物1279bp，将扩增后的产物点样于1.5％TAE琼脂糖凝胶中，5V/cm电泳10min置于紫外下观察，PCR扩增线粒体D-Loop区片段电泳图如图2所示。

利用引物DLOOPF和DLOOPR双向测序PCR产物，准确获得所有样品D-Loop区的序列信息。

(3)猪线粒体基因组D-Loop区多态位点鉴定以及单倍型和单倍型群的构建
利用MEGA7软件将测得的243条序列进行比对，共检测出48个多态位点，如表1所示，利用FaBox软件比对发现这243条序列共组成22个单倍型(H1-H22)，利用Network软件对22个单倍型进行聚类分析，发现其聚类到4个明显不同的单倍型群(HG1-HG4)，如图3所示。

(4)单倍型、单倍型群与猪背膘厚关联分析
利用sas8.2软件，通过ANOVA中Linear Models的Duncan’s Multiple Range Text分析mtDNA单倍型/单倍型群与猪背膘厚的相关性。

关联分析发现mtDNA单倍型群与猪背膘厚性状显著相关。

如表2所示：单倍型群HG2、HG3和HG4母猪的背膘厚均极显著高于单倍型群HG1母猪(P<0.001)。

其中，单倍型群HG1和HG3母猪之间的背膘厚差异最大，达到2.47mm(P<0.001)。

表2单倍型群与猪背膘厚关联分析。

上标中不同字母表示差异极显著P<0.001。

选择个体数大于3头的mtDNA单倍型与猪背膘厚性状进行关联分析：发现mtDNA单倍型H4(属于单倍型群HG1)的母猪背膘厚极显著低于其它单倍型的母猪群体(P<0.01)，如表3所示。

其中，mtDNA单倍型H14母猪群体与单倍型H4母猪群体的背膘厚差异最大，其mtDNA单倍型效应达到3.20mm(P<0.01)。

表3单倍型与猪背膘厚关联分析。

上标中不同字母表示差异极显著P<0.01。

(5)标记辅助育种
通过PCR手段利用引物DLOOPF和DLOOPR检测猪线粒体基因组单倍型。

引物序列、扩增体系及反应条件同步骤2。

将单倍型H4作为猪背膘厚育种的相关基因标记，将携带该单倍型的猪进行繁殖，在仔猪出生后，鉴定该标记，通过综合选种，从中筛选出低背膘厚的猪，培养低背膘厚的优良猪种。

综上所述：在长大二元杂交母猪的线粒体基因组D-Loop区创造性地发现单倍型H4的6月龄母猪背膘厚极显著低于其它单倍型，即单倍型H4与低猪背膘厚性状相关，并获得了通过检测猪线粒体基因组D-Loop区的单倍型H4作为与猪低背膘厚相关联的分子育种标记方法，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

序列表
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