诱惑红溶液标准物质的研制及不确定度评定

诱惑红溶液标准物质的研制及不确定度评定
马康;杨亚楠;邢金京;赵敏;张培成
【摘要】A methodology regarding the preparation and certification of certified reference material ( CRM) of allure red solution was presented. After the qualitative analysis on pure substance of allure red by liquid chromatography -mass spectrometry(LC -LTQ/MS) and 'H NMR spectrum, the purity of allure red was certified by high performance liquid chromatography ( HPLC) , the purity certification of allure red was performed at 240 nm with methanol and 0. 1 mol/L ammonium acetate solution as mobile phase, and the Intersil ODS-C18 column(250 mm ×4. 6 mm, 5 μm) was used for analysis. The certification purity of allure red was 99.61% . To verify the result, six certification labs were performed, at the same time, the water content and volatile impurity were determined by the total gravimetric analysis ( TGA). Allure red solution CRM was prepared by the gravity-volume method. After the tests of homogeneity and stability, the concentration of allure red solution CRM was certified and the uncertainty was evaluated. The certified result was 100 mg/L and the expanded relative uncertainty was 1.0% ( k =2). The allure red solution CRM was approved as a national CRM and could be applied in food safety detection.%建立了食用合成色素诱惑红溶液标准物质的制备和定值方法,研制了100 mg/L的诱惑红溶液标准物质.采用制备液相色谱对筛选的市售原料纯化,得到纯度大于99％的诱惑红纯品；通过核磁共振(1H NMR谱)和液相色谱-质谱(HPLC - LTQ/MS)准确定性分析后,利用高效液相色谱法(HPLC)对诱惑红纯物质进行纯度
定值.以0.1 mol/L乙酸铵和甲醇为流动相进行等度洗脱,采用Intersil ODS-
C18(250 mm×4.6 mm,5μm)进行分离,检测波长240 nm.为保证纯度测量的准确性,采用多家联合定值对诱惑红的纯度进行定值,诱惑红纯物质的定值纯度为99.61％(λ=240 nm).诱惑红溶液标准物质经重量-容量法配制后,进行均匀性和稳定性实验,浓度赋值后进行不确定度评定,诱惑红溶液的量值为100 mg/L,扩展相对不确定度
为1.0％(k=2).该溶液标准物质已批准为国家级标准物质,可为相关部门提供检测标准.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2012(031)003
【总页数】6页(P296-301)
【关键词】诱惑红;溶液标准物质;液相色谱法;不确定度评定
【作者】马康;杨亚楠;邢金京;赵敏;张培成
【作者单位】中国计量科学研究院分析科学与化学计量研究所,北京100013;中国
医学科学研究院药物研究所,北京100050;江苏省计量科学研究院化学所,江苏南京210007;中国计量科学研究院分析科学与化学计量研究所,北京100013;中国医学
科学研究院药物研究所,北京100050
【正文语种】中文
【中图分类】O657.7;TS264.4
食用合成色素是一类重要的食品添加剂，广泛应用于补偿食品在加工和储存过程中天然色素的损失，但过量食用或接触将危害人体健康。

因此，世界卫生组织(WHO)
和联合国粮食和农业组织(FAO)对于合成色素的安全数据(如每日摄入量)进行了反复测量和评价［1］，且许多国家要求在食品标签上标明添加的合成色素种类［2］。

目前我国允许使用的食用合成色素有柠檬黄、日落黄、胭脂红、亮蓝、苋菜红、诱惑红、新红、赤藓红、靛蓝、喹啉黄［3］，并明确规定了其使用限量和检测方法［4－5］。

其中诱惑红 (Allura red，CI16035)是一种典型的食用合成色素，分子式为C18H14 N2Na2O8S2，其化学结构见图1。

诱惑红为水溶性合成色素，呈鲜艳的深红色，广泛应用于糖果包衣、冰淇淋、雪糕、糖果、糕点、饮料等的着色。

由于诱惑红具有一定的致畸性，在《食品添加剂使用卫生标准》(GB 2760－2011)中明确规定了其在食品中的用量［6］。

目前文献报道诱惑红及其它色素的分析方法包括液相色谱法［7－10］、毛细管电泳法［11－12］和液相色谱串联质谱法［13－14］等，但这些方法均为相对法，需要诱惑红溶液标准物质才能准确定量。

为支持食用合成色素的检测分析，确保检测结果的可靠性、可比性和溯源性，为食品中合成色素的检测提供技术支撑，本文首次报道了诱惑红溶液标准物质的研制过程，并评价了标准物质的制备及分析过程对定值结果的不确定度。

图1 诱惑红的化学结构式Fig.1 Chemical structure of allure red
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
HPLC-1200高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(美国安捷伦公司);LTQ Advantage ion trap高效液相色谱串联质谱仪(美国Thermo公司);Inova-500核磁共振仪(美国Varian公司);XP-205电子天平(瑞士梅特勒公司);Milli-Q超纯水制备器(美国Millipore公司);诱惑红原料(上海染料研究所)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，去离子水由超纯水制备器提供;醋酸铵(分析纯，北京化工厂)，Sephadex LH-20填料(美国GE公司)。

1.2 实验条件
1.2.1 液相色谱质谱(LTQ)条件 LTQ Advantage ion trap(美国Thermo公司)，使用Finnigan Xcalibur数据处理系统。

ESI源:正离子检测;扫描范围:m/z80～600;
柱后分流比:3∶1;鞘气流:50 arb;辅助气流:10 arb，源电压:4.50 kV;毛细管温
度:330℃;毛细管电压:5.00 kV;透镜补偿电压:20.00 V;相对碰撞能量:45%。

碰撞气:50%～70%;离子选择宽度:3.000 amu;离子分离时间:20 ms。

1.2.2 液相色谱(HPLC)条件色谱柱:ODS-C18(4.6 mm×250 mm×5μm，日本GL Science公司);柱温:35℃;流动相:甲醇+0.10 mol/L乙酸铵水溶液(体积比30∶70)，流量:1.0 mL/min;进样量:20μL;二极管阵列检测器波长:240、510 nm。

1.3 标准物质制备
1.3.1 诱惑红纯品制备诱惑红纯品是通过制备液相色谱将原料进行纯化获得。

实验过程如下:首先称取Sephadex LH-20填料进行色谱柱填装，分别用甲醇和水为流动相冲洗填装好的色谱柱直至色谱柱洗脱平衡。

称取诱惑红原料，置三角瓶中用水充分溶解后，以0.45μm滤膜过滤，滤液进入色谱柱分离纯化，紫外检测器
(λ=240 nm)检测，分段收集流分得到诱惑红，重复上述操作多次。

将收集到的所有流分进行冷冻干燥，并对干燥后的样品进行液相色谱分析，得到纯度大于99%
的诱惑红纯品，将诱惑红纯品在70～80℃下真空干燥5 h。

1.3.2 诱惑红溶液标准物质制备溶液标准物质采用纯品原料经重量－容量法精确制备:使用检定合格的分析天平(分度0.000 1 mg)准确称量经过纯度分析的标准物质
原料纯品100～300 mg，转移溶质于准确称重过的洁净锥形瓶中。

在另一分析天平(分度1 mg)上加入一定质量的纯净水至1 000 mL容量瓶中，充分混匀(质量浓度为100 mg/L)。

样品混匀后立即在低温冷冻条件下，用洁净的安瓿瓶分装、熔封、贴标签。

置于冰箱4℃冷冻避光保存，以备均匀性检验、稳定性考察和色谱定值核验。

1.4 均匀性及稳定性检验
依据标准物质研制的技术规范［15－16］，从制备的500瓶溶液样品中随机抽取10瓶做均匀性检验，其中1瓶重复测定9次，做瓶内均匀性检测，其余9瓶每瓶测定1次做瓶间均匀性检测，取样量均为20μL。

稳定性检验按短期稳定性和长期稳定性分别进行，短期稳定性检验是将4组样品(每组6瓶)分别存放在－10、4、20、70℃条件下，4周后取出，用HPLC－UV测定溶液浓度;长期稳定性检验是将两组样品(每组6瓶)分别保存在4℃和20℃条件下，储存1、3、5、7、10、12月后各取出一瓶测定溶液浓度。

1.5 水分及挥发性杂质的分析
采用热重法(TGA法)进行水分的测定［17］。

TGA法是在程序控制温度下，观察和测量物质在加热过程中的重量变化，并通过这种变化研究物质在加热过程中所产生的具有重量变化的反应。

TGA法常用热天平称量其重量的变化，从而得出水分的量，通常称量样品量约为3～5 mg。

2 结果与讨论
2.1 诱惑红的定性分析
诱惑红的结构通过液相质谱(LTQ)和核磁共振(1H NMR谱)确定。

诱惑红的ESI MS和1H NMR结构鉴定图谱见图2～3。

其中图2给出了［M－Na］－473、458、441、413、349、331共 6个负离子峰，分别表示该化合物脱去1个钠离子后产生m/z 473的负离子峰，接着脱去1个甲基后得到m/z 458的峰，再脱去1个羟基得到m/z441的峰，m/z413为m/z441脱去1个羰基后得到的峰，m/z 413脱去SO2和1个O分别得到m/z 349和m/z 331的峰。

此外，图 3给出了以下数据:δ7.859、δ7.704、δ7.642、δ7.114、δ6.940、δ6.027、δ3.496 和δ2.342。

从以上数据可以确定为诱惑红的结构。

2.2 纯物质的定值分析
纯品原料中主成分定值方法参照各个国家计量实验室的通用方法。

对样品纯度为99%以上的化合物，通常选择高效液相色谱(HPLC)归一化法作为有机化合物纯度
定值的主要方法［18］。

诱惑红纯品采用多家实验室联合HPLC纯度定值的方法，共有6家实验室参与，
每家实验室7瓶样品，其中l瓶提供7个纯度值，其余6瓶各给出3个纯度值。

分别利用柯克伦检验和狄克逊检验对6家实验室的数据进行检验，测得的数据经
检验符合正态分布后，计算平均值及标准偏差，结果见表1。

由多家实验室合作定值可以确定诱惑红纯品的纯度为99.61%。

样品中水分和挥发性物质由热重法(TGA)测定，在制备诱惑红纯品时已于70～80℃真空干燥5 h，大部分可挥发性
物质已被除掉，测量结果小于0.01%(10μg/g);灰分含量是将样品在马弗炉中1 200℃下灼烧，根据灼烧前后样品的质量差来确定，灰分的测量结果小于0.01%。

表1 诱惑红多家合作定值结果Table1 Multi-lab certification result of allure red?
(续表1)?
2.3 均匀性结果分析
对均匀性检验结果做F检验和T检验，在95%置信范围内，瓶间和瓶内不存在显
著性差异(见表2)，说明标准物质的均匀性良好。

表2 诱惑红溶液标准物质均匀性检验结果Table2 Homogeneity testing result
of allure red solution?
2.4 稳定性结果分析
稳定性检验结果见表3。

对长期稳定性结果进行一致性检验，数据通过了T检验。

标准物质稳定性检测结果表明，在规定的储存条件和时间范围内，诱惑红溶液测定值的变化范围均在特性量值的不确定度范围内，并无明显的方向性变化趋势，在4℃保存，可保证其量值在1年内稳定。

表3 诱惑红溶液标准物质稳定性检测结果Table3 Stability testing result of allure red solution w/%?
(续表3)?
图4 诱惑红溶液的不确定度来源图Fig.4 Uncertainty resource for allure red solution certified reference material
2.5 不确定度分析
诱惑红溶液标准物质的不确定度包括纯品纯度定值、溶液制备过程、溶液均匀性与稳定性检验，不确定度的具体来源见图4。

2.5.1 纯度定值不确定度诱惑红纯度定值结果的不确定度评定参考文献［19－20］进行，其不确定度分量主要包括:①纯度合作定值的重复性;②液相色谱仪(UV)的相对质量校正因子;③仪器线性引入的不确定度;④水分和挥发性有机溶剂测定。

表4
是诱惑红溶液定值结果不确定度的各分量计算，包括A类不确定度(合作定值所用方法的重复性)以及B类不确定度(即响应因子产生的不确定度等)。

最终合成纯品
的不确定度为0.3%。

表4 诱惑红溶液定值结果不确定度评定Table4 Uncertainty for allure red solution certification with HPLC method?
2.5.2 溶液制备过程不确定度①天平称量引入的不确定度。

天平称量不确定度来源:A.天平称量最大允许误差;B.天平称量变动性;C.浮力影响。

纯品原料称量使用
0.001 mg分度的分析天平，天平的变动性、检定误差等估计为0.005 mg，天平
称量变动性及浮力影响在常规状态下称重可忽略。

纯品称重约100 mg，按矩形分布相对不确定度=(Δm/m)=(0.005 mg/100 mg)/=0.002 9%。

3次水的称量使用0.01 g分度的分析天平，天平的变动性、检定误差等估计为0.01 g，称样量为1 000 g，按矩形分布计算相对不确定度=(Δm/m)/3=(0.01 g/1 000 g)/=0.000 58%。

②定容体积引入不确定度。

定容体积不确定度来源:A.容量瓶校准对体积的影响;B.
温度对体积的影响;C.至容量瓶刻度线重复性对体积的影响。

溶液配制定容体积为1 000 mL，检定合格的1 000 mL容量瓶最大允差为±0.50 mL。

假定为三角形分布，此项标准不确定度为 0 .50/=0.20 mL;本方法根据加入3次水的质量计算溶液体积，所以需考虑温度对3次水体积的影响而引入的不确定度。

实验温度控制在
(25±5)℃，纯水的膨胀系数为0.000 21 L/℃，因此产生的体积变化为(1
L×5×0.000 21 L)×1 000=±1.05 mL，假定温度变化为矩形分布，则标准不确定
度为 1 .05/=0.61 mL;通过多次充满1 000 mL容量瓶至刻度并称量的实验，得出标准偏差为0.10 mL。

综上所述，定容体积引入的相对合成不确定度为0.080%。

③其它客观不定性因素造成的不确定度。

制备分装、熔封溶液过程对量值也会有影响。

推测这些客观存在的不定性因素对溶液浓度造成的不确定度为0.20%。

2.5.3 溶液均匀性与稳定性引入不确定度由溶液均匀性检验结果可知，各溶液瓶内及瓶间无显著性差异，溶液是均匀的。

溶液的稳定性考察结果表明，溶液在测量期间的量值无趋向性变化，在考察期间稳定。

因此，由溶液均匀性和稳定性引入的不确定度可以忽略。

由此得到诱惑红溶液标准物质的相对合成不确定度u合成rel= =0.38%，扩展相
对不确定度U=1.0%(k=2)。

3结论
采用制备液相色谱将市售原料纯化，得到纯度大于99%的诱惑红纯品;通过核磁共振(1 H NMR谱)和液相色谱－质谱(HPLC－LTQ/MS)准确定性分析后，进行水分
和挥发性杂质含量分析，采用HPLC面积归一化多家定值方法对诱惑红纯品进行
纯度定值;通过重量法配制100 mg/L的诱惑红水溶液标准物质，进行了均匀性、
稳定性检测，并对浓度定值结果进行了不确定评估。

所研制的系列标准物质有质量保证，对于保证实验室测量结果的准确可靠与互认，避免在食品检测中出现“测不准”问题具有极其重要的现实意义。

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