熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞分化的促进作用

熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞分化的促进作
用
李梦红;姜欢;王六一;冯旭;刘楠;胡敏
【摘要】目的:探讨熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞分化的影响,为牙根吸收的修复提供理论依据.方法:将对数生长期的OCCM-30细胞分为对照组和不同浓度熊果酸组.其中熊果酸组OCCM-30细胞以3种浓度(0.625、1.250和2.500μmol·L-1)的熊果酸处理,对照组不做任何处理.采用MTT法检测不同时间点(24、48和72 h)各组OCCM-30细胞增殖抑制率,碱性磷酸酶(ALP)法检测细胞体外分化和矿化情况,实时定量PCR法检测24 h内骨桥蛋白(OPN)mRNA表达水平,Western blotting法检测给药3和5 d时OPN蛋白表达水平.结果:不同浓度熊果酸组与对照组OCCM-30细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05).与对照组比较,2.500μmol·L-1熊果酸组熊果酸处理3、5和7 d后,OCCM-30细胞中ALP活性明显升高(P<0.05),不同浓度熊果酸组OCCM-30细胞中OPN mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01).结论:一定浓度熊果酸对小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30细胞增殖无明显抑制作用,但可促进其分化并上调OPN mRNA和蛋白表达水平.
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(045)005
【总页数】6页(P986-991)
【关键词】熊果酸;成牙骨质细胞;细胞增殖;细胞分化
【作者】李梦红;姜欢;王六一;冯旭;刘楠;胡敏
【作者单位】吉林大学口腔医院正畸科,吉林长春130021;吉林省牙发育与颌骨重
塑及再生重点实验室,吉林长春130021;吉林大学口腔医院正畸科,吉林长春130021;吉林大学口腔医院正畸科,吉林长春130021;吉林大学口腔医院正畸科,吉
林长春130021;吉林大学口腔医院正畸科,吉林长春130021;吉林大学口腔医院正
畸科,吉林长春130021
【正文语种】中文
【中图分类】R783.5;R363
正畸牙移动是围绕牙根的相关骨组织和周围的软组织在结构和形态上发生动态变
化的结果。

在这一过程中，20%以上牙根会发生不同程度的吸收[1]，具体表现为
根面凹陷、牙根变短及牙齿松动甚至脱落[2]。

尽管多数牙根吸收不会危及牙齿的
生理功能和生存状态，但由于其多发性和高发性，已受到正畸学者的广泛关注[1]。

成牙骨质细胞附着于牙根表面，其可以形成前期牙骨质，后经矿化为成熟牙骨质，在牙根吸收的修复过程中起重要作用[3]。

熊果酸是在植物界分布极为广泛的一种
五环三萜类化合物，可从希腊鼠尾草和夹竹桃等植物中提取[4]。

近年来，研究者
着重于研究熊果酸在骨重塑方面的作用发现：其可以刺激成骨细胞分化，提高新骨形成，抑制骨吸收，因此被用于治疗骨质疏松症等[5-9]。

熊果酸也可以促成骨样
细胞小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)中骨保护素(OPG)、雌激素受体(ER)
和磷脂肌醇(PKC)的表达，此作用与核因子κB(NF-κB)通路相关[10]。

本文作者在
前期研究[11]中发现：以一定浓度的熊果酸刺激矿化诱导中的成牙骨质细胞系OCCM-30细胞，可以提高其碱性磷酸酶(ALP)活性，促进矿化结节的形成，但熊
果酸对于OCCM-30细胞矿化相关机制的调控尚不明确。

本实验以一定浓度的熊
果酸作用于OCCM-30细胞，检测其对OCCM-30细胞增殖抑制率、ALP活性以
及骨桥蛋白(OPN)mRNA和蛋白表达水平的影响，为牙根吸收的修复提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂和仪器成牙骨质细胞系OCCM-30细胞(四川大学华西口腔医院白丁教授惠赠)；熊果酸单体(美国Sigma公司，产品代码897977，纯度
99.8%)，ALP试剂盒和BCA法蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)，细胞
培养基和双抗(美国Hyclone公司)，胰酶和小牛血清 (美国Gibco公司)，OPN抗体(美国Abcam公司)，实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)；细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 引物序列 OPN和β-actin引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，所
用引物序列如下：OPN 上游引物，5′-AGCTTGGCTTATGGACTGAGG-3′,下游引物,5′-CAGGGATGACATCGAGGGAC-3′;β-actin 上游引物,5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′,下游引物,5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。

1.3 成牙骨质细胞的培养采用含有10%小牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养液培养OCCM-30细胞。

置于37℃、含5%CO2、饱和湿度培养箱中，细胞生长至80%时在无菌条件下传代，用预热PBS清洗3次，用0.5 mL胰蛋白酶消化细胞，显微镜下见细胞变圆，开始脱落时用含血清的培养液终止反应，1 000 r·min-1 离心5 min后弃去上清液，加入新鲜培养基，吹散细胞制成悬液，按1∶3传代，每2 d换液，选择对数生长期细胞用于实验。

1.4 MTT法检测细胞增殖抑制率用胰蛋白酶消化OCCM-30细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，培养24 h后进行分组，每组均设3个复孔，对照组和
不同浓度熊果酸组分别加入0、0.625、1.250和2.500 μmol·L-1熊果酸，分别在
加入熊果酸24、48和72 h后，每孔加入10 μL 浓度为5 g·L-1的MTT溶液，
置于培养箱中孵育4 h后小心吸干培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温置于摇床上10 min后，使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度(A)值，计算
细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5 碱性磷酸酶法检测细胞矿化以每孔1×105个细胞接种到6孔板中，24 h后
分为对照组和熊果酸组，分别加入0和2.500 μmol· L-1熊果酸于高糖培养液中，隔日换液，在加药后1、3、5和7 d检测细胞中ALP水平，按照试剂盒说明书操作。

每孔细胞用1 mL预冷PBS洗2次，再用100 μL细胞裂解液RIPA裂解细胞，4℃、13 000 r · min-1离心10 min后，取上清液用试剂盒检测ALP活性，每组设置3个复孔，在520 nm波长处检测各孔A值，并采用BCA试剂盒检测蛋白质总量。

ALP活性(U·g-1)=(测定孔A 值-空白孔A值)/(标准孔A值-空白孔A值)×
酚标准品浓度(0.1 g·L-1)/待测样本蛋白浓度(g·mL-1)。

1.6 RT-PCR法检测细胞中OPN mRNA表达水平 OCCM-30细胞以每孔1×105
个接种到6孔板中，24 h 后进行分组，分别加入浓度为0.625、1.250和2.500
μmol·L-1的熊果酸于高糖培养液中，对照组不加任何刺激，隔日换液，在加药后3、6、12、18和24 h分别提取各组总RNA，按照cDNA合成试剂盒操作说明
将所得总RNA逆转录为cDNA，RT-PCR反应参照试剂盒说明书，目的基因为OPN，内参为β-actin。

采用2-ΔΔCt法计算OPN mRNA相对表达水平。

1.7 Western blotting法检测细胞中OPN蛋白表达水平细胞分组及药物刺激同1.6，在加药后3和5 d分别提取总蛋白。

即PBS冲洗2次，用细胞裂解液
RIPA(加入1‰蛋白酶抑制剂)裂解细胞，4℃、13 000 r · min-1离心10 min后
提取上清液，采用BCA试剂盒检测蛋白表达水平。

根据样品体积加入适量的
4×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸变性。

配置SDS-PAGE凝胶后，上样，进行电泳及转膜。

然后将PVDF膜浸于5%BSA中孵育1 h。

加入一抗4℃孵育过夜，
TBST洗膜后，37℃孵育二抗1.5 h，TRST洗膜后置于曝光机内显影，并采用Gel Image System 4.2软件测量各条带的面积及灰度值。

以β-actin为内参，以
OPN/β-actin条带灰度值比值表示OPN蛋白表达水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。

各组OCCM-30细胞
增殖抑制率、ALP活性、OPN mRNA和蛋白表达水平均符合正态分布及方差齐性，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组OCCM-30细胞增殖抑制率与对照组比较，不同浓度(0.625、1.250和2.500 μmol·L-1)的熊果酸作用细胞24、48和72 h，细胞增殖抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

见表1。

表1 不同浓度熊果酸作用不同时间后OCCM-30细胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of OCCM-30 cells in various groups after treated with different concentrations of ursolic acid for different time GroupInhibitoryrateofproliferation(t/h) 244872Ursolicacid(μmol·L-1)
0.6250.070±0.0070.100±0.0700.040±0.005
1.2500.070±0.0200.120±0.0600.080±0.040
2.5000.070±0.0050.050±0.0300.080±0.040F0.3151.1840.708P0.7410.3690.5 29
*P<0.05 compared with control group.
2.2 各组OCCM-30细胞中ALP活性与对照组(
3.580±0.007)比较，2.500
μmol·L-1熊果酸作用3、5和7 d OCCM-30细胞中ALP活性(4.030±0.140，4.840±0.060，6.060±0.080)明显升高(P<0.05)。

提示熊果酸能有效诱导OCCM-30细胞成骨分化。

2.3 各组OCCM-30细胞中OPN mRNA和蛋白的表达水平与对照组比较，不同
浓度熊果酸组OCCM-30细胞中OPN mRNA表达水平均明显升高；各组总体均
数比较差异有统计学意义(P<0.01)。

与对照组比较，0.625 μmol·L-1熊果酸作用
6 h OPN mRNA表达水平开始升高(P<0.05)，12 h时OPN mRNA的表达水平
达到峰值，约为对照组的6倍；与对照组比较，1.250 μmol·L-1熊果酸组作用3
h时OPN mRNA表达水平即升高(P<0.05)，作用6 h时，OPN mRNA表达水平达到峰值，约为对照组的3.48倍；与对照组比较，2.500 μmol·L-1熊果酸组作用6 h时OPN mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，约为对照组的8倍。

见表2。

表2 不同浓度熊果酸作用不同时间后各组OCCM-30细胞中OPN mRNA表达水
平Tab.2 Expression levels of OPN mRNA in OCCM-30 cells in various groups after treated with different concentrations of ursolic acid for different timeGroupExpressionlevelofOPNmRNA(t/h)
36121824Control1.000±0.0501.000±0.1701.000±0.0501.000±0.0201.000±0 .100Ursolicacid(μmol·L-1)
0.6250.950±0.0401.190±0.030∗5.870±0.470∗2.900±0.290∗0.980±0.130
1.2501.990±1.140∗3.480±0.470∗0.890±0.0201.040±0.1101.000±0.050
2.5000.980±0.0067.950±0.100∗1.600±0.140∗1.060±0.1201.000±0.070F126. 008478.318279.3429
3.1510.046P<0.01<0.01<0.01<0.010.986
*P<0.05 compared with control group.
Western blotting法检测结果显示：在不同浓度熊果酸作用后3和5 d，与对照
组比较，不同浓度熊果酸组OCCM-30细胞OPN蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。

见图1和表3。

A:3 d; B:5 ne 1: Control group; Lane 2-4: 0.625,1.250,and 2.500 μmol·L-
1 ursolic acid groups.图1 各组OCCM-30细胞中OPN蛋白表达电泳图Fig.1
Electrophoregram of expressions of OPN protein in OCCM-30 cells in various groups
3 讨论
熊果酸具有毒性低和不良反应小等优势，目前已被广泛应用于保肝、抗癌和抗病毒等方面。

近年来，因其具有促进骨形成和抑制骨吸收的特性，已经作为抗骨质疏松药的主要成分被广泛应用于临床。

熊果酸可通过激活促分裂原活化蛋白激酶、NF-κB以及活化蛋白-1来调控OPN和骨钙素(OCN)等的表达[6]；研究[12]表明：在成骨细胞中，高表达的Runx2可以激活OCN和OPN的转录及表达，进而促进骨成熟。

表3 不同浓度熊果酸作用不同时间后各组OCCM-30细胞中OPN蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of OPN protein in OCCM-30 cells in various groups after treated with different concentations of ursolic acid for different timeGroupExpressionlevelofOPNprotein(t/d)35Control1.180±0.060
1.180±0.005 Ursolicacid(μmol·L-1) 0.6251.450±0.020∗4.470±0.070∗
1.2503.410±0.060∗6.980±0.130∗
2.5006.820±0.060∗7.270±0.100∗F7392.4293111.385P<0.01<0.01
*P<0.05 compared with control group.
本课题组前期研究结果[11]显示：适宜浓度熊果酸可以上调成牙骨质细胞ALP表达和矿化结节形成量，促进成牙骨质细胞矿化。

但不同浓度的熊果酸如何影响矿化相关标志物在基因和蛋白水平的表达尚未明确。

为研究这一问题，本实验以OCCM-30细胞系为研究对象，参考前期实验结果设定熊果酸浓度梯度，首先采用MTT法检测熊果酸对细胞增殖的影响，结果显示：熊果酸组细胞增殖抑制率无明显变化，实验结果与前期研究结果基本一致[11]。

ALP是成骨细胞分泌的一组膜结合糖蛋白，是成骨细胞早期分化的特异性标志，
与骨组织重建和骨基质矿化密切相关[13]。

ALP活性的高低，能较客观地反映成骨细胞分化成熟的程度[14]。

本实验中，与对照组比较，作用3、5和7 d熊果酸组ALP活性升高(P<0.05)，提示熊果酸可促进细胞矿化。

与前期细胞培养条件不同，本实验采用高糖DMEM培养液，而不是矿化诱导液培养细胞诱导分化，在此培养条件下，OCCM-30细胞ALP活性增强，故而推断熊
果酸具有诱导成牙骨质细胞分化的作用，其促进矿化的作用可不依赖于矿化诱导液的存在。

本文作者研究熊果酸作用下OCCM-30细胞中多种矿化相关标志物在基因和蛋白
水平的表达情况，结果显示：其中OPN上调最为稳定和明显。

OPN是一种多功能、分泌型糖蛋白，主要表达于骨形成早期，是成骨细胞的特征性表型标志，可
由成骨细胞分泌并储存于骨基质中，将自身同骨基质连接，促进矿化组织的重建[15]。

在口腔医学中，OPN可以促进牙体和牙槽骨的形成和矿化[16]；在骨质疏
松症的研究中，OPN是矿化特异性标志物之一，其表达水平下降表征骨流失及骨
质疏松[17-18]。

但也有研究[19]显示：OPN对成骨细胞增殖和分化具有抑制作用，成为引发骨质疏松症及其他骨质缺失疾病的重要原因。

上述差异可能归因于不同的实验体系或研究条件，亦或与其翻译后修饰形式以及相关靶细胞的受体表达差异等多重因素有关。

本研究结果显示：与对照组比较，在熊果酸浓度为1.250 μmol·L-1时，OPN mRNA表达水平明显升高(3 h)；在熊果酸浓度为2.500 μmol·L-1时，OPN mRNA表达水平上调最明显(约为对照组的8倍)，OPN蛋白表达水平上调
也最为明显(约为对照组的7倍)。

近年来，熊果酸在骨重塑机制方面的研究已日趋广泛，熊果酸在骨形成过程中可以促进前成骨细胞的增殖、刺激成骨细胞和前成骨细胞的分化，还可以抑制成骨细胞的凋亡，从而实现对骨形成的促进作用[20]；在骨吸收过程中，能够抑制破骨前体细胞分化，阻碍破骨细胞的骨吸收，从而实现对骨吸收的抑制作用[21-22]。

但是
对于熊果酸促进成牙骨质细胞矿化，亦或抑制破骨细胞吸收的机制，目前尚不十分明确。

本课题组下一步将以OPN上调为切入点，探寻熊果酸促进成牙骨质细胞矿化的相关信号通路，为正畸过程中牙根吸收的治疗提供依据。

[参考文献]
【相关文献】
[1] DENG Y Q, SUN Y N, XU T M. Evaluation of root resorption after comprehensive orthodontic treatment using cone beam computed tomography (CBCT): a meta-analysis[J].BMC Oral Health, 2018, 18(1):116-129.
[2] VIECILLI R F, KAR-KURI M H, VARRIALE J, et al. Effects of Initial Stresses and Time on Orthodontic External Root Resorption[J]. J Dent Res, 2013, 92(4):346-351.
[3] 吴卫锋, 郭淑娟, 吴亚菲. 成牙骨质细胞的研究进展[J]. 国际口腔医学杂志, 2011, 38(1):95-97.
[4] SEO D Y, LEE S R, HEO J W, et al. Ursolic acid in health and disease[J]. Korean J Physiol Pharmacol, 2018, 22(3):235-248.
[5] WZNIK , SKAPSKA S, MARSZAEK K. Ursolic acid-A pentacyclic triterpenoid with a wide spectrum of pharmacological activities[J]. Molecules, 2015, 20(11): 20614-20641.
[6] LEE S U, PARK S J, KWAK H B, et al. Anabolic activity of ursolic acid in bone: Stimulating osteoblast differentiation in vitro and inducing new bone formation in vivo[J]. Pharmacol Res, 2008, 58(5/6):290-296.
[7] 李琴, 范迎赛, 高宗勤,等. 齐墩果酸和熊果酸对MC3T3-E1细胞增殖及OPG蛋白表达影响的机制研究[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2015(15):51-54.
[8] 王玉琢,崔聪聪,包幸福,等.熊果酸对骨重塑的相关研究进展[J].中国实验诊断学,2016,20(8):1402-1405.
[9] GUO Y B,LI Y,XUE L M,et al.Salvia miltiorrhiza: An ancient Chinese herbal medicine as a source for anti-osteoporotic drugs[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 155(3):1401-1416. [10] TAN H, ASHOUR A, KATAKURA Y, et al. A structure-activity relationship study on antiosteoclastogenesis effect of triterpenoids from the leaves of loquat (Eriobotrya Japonica)[J]. Phytomedicine, 2015, 22(4):498-503.
[11] 王玉琢,包幸福,姜欢,等.熊果酸对成牙骨质细胞增殖及矿化功能的影响[J].口腔医学研
究,2016,32(12):1229-1233.
[12] KIM H J, PARK J W, LEE K H, et al. Plant homeodomain finger protein 2 promotes
bone formation by demethylating and activating Runx2 for osteoblast differentiation[J]. Cell Res, 2014, 24(10):1231-1249.
[13] 王艳芬, 牛光良, 韩建民，等. 氧化锆微米涂层对成骨细胞增殖和分化的影响 [J]. 中华口腔医学杂志,2018,53(5): 339-343.
[14] SHAO H Y, ZHANG Y G, YANG X, et al. Effects of inhibitory concentration minocycline on the proliferation, differentiation, and mineralization of osteoblasts[J]. Huaxi Kouqiang Yixue Zazhi, 2018,36(2):140-145.
[15] RODRIGUEZ D E, THULA-MATA T, TORO E J, et al. Multifunctional role of osteopontin in directing intrafibrillar mineralization of collagen and activation of osteoclasts[J]. Acta Biomater, 2014, 10(1):494-507.
[16] FOSTER B L, AO M, SALMON C R, et al. Osteopontin regulates dentin and alveolar bone development and mineralization[J]. Bone, 2018,107:196-207.
[17] CHATAKUN P,NUEZ-TOLDRR,DAZ LPEZ E J, et al. The effect of five proteins on stem cells used for osteoblast differentiation and proliferation: a current review of the literature[J]. Cell Mol Life Sci, 2014, 71(1):113-142.
[18] WAN Y M, MA Y J, ZHANG X Y, et al. Effects of rotation on osteonectin and osteopontin mRNA level of cultured osteoblasts in rats[J]. Sheng Li Xue Bao, 2005,
57(3):384-388.
[19] HUANG W B, CARLSEN B, RUDKIN G, et al. Osteopontin is a negative regulator of proliferation and differentiation in MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells[J]. Bone, 2004,
34(5):799-808.
[20] LI Q,FAN Y S,GAO Z Q,et al.Effect of fructus ligustri lucidi on osteoblastic like cell-line MC3T3-E1[J]. J Ethnopharmacol, 2015, 170:88-95.
[21] JIANG C, XIAO F, GU X F, et al. Inhibitory effects of ursolic acid on osteoclastogenesis and titanium particle-induced osteolysis are mediated primarily via suppression of NF-κB signaling[J]. Biochimie, 2015, 111:107-118.
[22] FU H J, ZHOU Y R, BAO B H, et al. Tryptophan hydroxylase 1 (Tph-1)-targeted bone anabolic agents for osteoporosis[J]. J Med Chem, 2014, 57(11):4692-4709.。