传代细胞培养实验ppt课件
细胞的传代培养和细胞计数法
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
© ¨X 104£ Cell number£
M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
2 3 4 5 6 Days in culture
7
8
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• • • • • • • •
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
《细胞培养医学》课件
通过细胞培养技术可以实现对患者的细胞进行精准治疗和个性化用 药，提高治疗效果和安全性。
瘤学等研究。
20世纪70年代，随着组织工程 和再生医学的发展，细胞培养技 术在临床治疗中也得到了广泛应
用。
细胞培养技术的应用领域
基础研究
用于研究细胞的生长、发育、 分化、凋亡等基本生命过程， 为疾病的发生、发展和治疗提
供理论依据。
药物研发
用于筛选和验证药物的有效性 和安全性，为新药的研发提供 实验依据。
药物筛选与药理学研究
药物筛选
通过细胞培养技术，可以快速筛选出 具有药效的化合物，为新药研发提供 候选药物。
药理学研究
利用细胞培养模型，可以研究药物对 细胞的作用机制，为药物设计和优化 提供依据。
疾病模型的建立
疾病模拟
通过细胞培养技术，可以模拟人类疾病的发生和发展过程，为疾病机制研究和 药物筛选提供有效模型。
组织工程
用于构建人工组织和器官，为 临床治疗提供替代品和修复材 料。
再生医学
用于治疗和修复损伤组织和器 官，促进机体的再生和修复。
02 细胞培养的基本原理
细胞生长与增殖的机制
1 2
细胞周期
描述细胞从分裂间期到分裂期再到新的分裂间期 的循环过程，包括DNA复制、染色体分离等关键 事件。
细胞分裂
阐述细胞分裂的过程，包括有丝分裂和减数分裂 ，以及它们在细胞生长和增殖中的作用。
细胞培养的质量控制
培养基质量控制
确保培养基的成分、浓度和PH值等符合标准，以保证细胞的正常 生长和分化。
细胞污染控制
防止细菌、真菌等微生物污染，以及交叉污染，确保细胞的纯度和 安全性。
细胞生长曲线的测定
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
倒 置 显 微 镜
back
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液 氮 罐
back
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
《细胞传代》PPT课件
精选ppt
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也可将装有细胞的冻存管放入4 ℃ 冰箱 30min,-20℃冰箱30min ，然后放入70℃冰箱中过夜，最后移入液氮容器内
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注意事项
1.待冻存的细胞应具有较高的活力。从增殖期到形 成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻 存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最 好换一次培养液；
加入消化液5滴，翻转培养瓶，使消化液浸没细 胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现 细胞质回缩，胞体变圆)
加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面， 使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作 要轻柔不要用力过猛。
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将细胞悬液移至15ml离心管中， 1000rpm*5min离心。
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培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方 法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分 贴壁生长的细胞可直接吹打传代；悬浮生 长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后 传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹 打传代。
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操作步骤
选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养 瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后 连同培养液倒出，用D-Hanks洗1次。
高密度 上皮样细胞
悬浮 圆形 未转化
成纤维样
贴附 成纤维或上皮样
转化后
可成上皮样
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悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细 胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持 物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁 殖。
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体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞 的生存环境是甁皿等容器，生存空间和营养是有 限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出 一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代 （passage或subculture)。传代的频率与接种 细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有 关。
细胞培养PPT课件
悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见 于各种造血系统肿瘤细胞
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）
强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶1000
配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部 及身体裸露部分
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮状态, 也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞 体呈圆球形。
10分钟一4小时
贴壁期：
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均 在10分钟--4小时贴壁。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、
细胞培养基本技术
医学科研实验中心
基本概念
原代培养 从供体取得组织细胞后在体外进
行的首次培养。 传代培养
将培养的细胞从原培养瓶中加以 分离，经稀释后再接种于新的培养瓶 中。
细胞系(cell line)
原代培养物经首次传代成功后即为细 胞系。
细胞株(cell strain)
通过克隆形成法或选择法从原代培养物 细胞系中获得的具有特殊性质或标志的 培养物。
细胞培养技术的主要优点
㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。
细胞培养---原代培养---传代培养
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、
自动双重纯水蒸馏器
纯水仪
酶标仪
微孔板震荡器
培养器皿
Culture flask
Culture Plate
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
清洁液的配制
细胞培养基
干粉培养基和液体培养基
干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制
对数生长期：
细胞数随间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
二、细胞培养基本要求
常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂
培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要
原代培养与细胞系
原代培养
（primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细胞株
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
细胞的传代培养
实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。
2. 了解细胞传代培养的意义。
【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。
贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。
因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。
这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。
细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。
传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。
一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25℃，热带鱼类细胞为30℃，冷水鱼类细胞为20℃，哺乳动物细胞为37℃。
细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。
单纯换液不需要接种细胞。
【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640 或MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。
在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。
1．观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2．超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3．开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，培养瓶瓶口、瓶盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4．清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。
细胞传代实验步骤及原理
细胞传代实验步骤及原理细胞传代呀，就像是给细胞们搬个新家，让它们继续茁壮成长呢！咱先说说为啥要进行细胞传代吧。
你想啊，细胞们在一个小地方待久了，空间不够了呀，营养也不够分啦，这时候就得给它们挪个地儿，让它们能更好地生长、繁殖。
这就好比一群人住在小房子里，时间长了会觉得拥挤，得换个大房子住住才舒服嘛。
那怎么进行细胞传代呢？首先得准备好各种工具和材料呀，比如培养瓶、培养液、胰酶等等。
这就好像你要搬家得先准备好箱子、车子这些东西一样。
然后呢，把细胞从原来的培养瓶里取出来。
这可不能太粗鲁哦，得小心翼翼的，不然把细胞弄伤了可不好。
就好像你搬易碎品的时候得轻拿轻放一样。
这时候胰酶就派上用场啦，它能帮着把细胞从瓶底上“松一松”，让它们更容易被取出来。
取出来后，把细胞放到新的培养瓶里，再加入新鲜的培养液。
哇，细胞们这下可有了新的环境啦，又能开心地生长啦！这就像给人换了个新房间，还准备了好吃好喝的，多舒服呀。
不过这里面也有很多要注意的地方哦！比如胰酶的作用时间不能太长也不能太短，不然都会影响细胞的状态。
这就像做菜放盐一样，放多了太咸，放少了没味道。
还有啊，操作的时候一定要干净卫生，可不能让细菌什么的混进去，那细胞可就遭殃啦！细胞传代可是个细致活儿，得有耐心，还得细心。
你想想，细胞那么小，我们得像照顾小宝宝一样照顾它们呢。
要是不小心出了差错，那之前的努力可就白费啦！每次进行细胞传代的时候，我都觉得自己像个小园丁，在照顾着我心爱的小花朵们。
看着它们在新的环境里健康生长，心里那叫一个美呀！总之呢，细胞传代是细胞培养中非常重要的一步，只有做好了这一步，我们才能让细胞更好地为我们的研究和实验服务呀！所以呀，大家可千万不能马虎哦！一定要认真对待每一次细胞传代，让我们的细胞宝宝们茁壮成长吧！。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).ppt
镜下观察，标明名称，序号和日期。
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6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，
用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下
观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。
15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。
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16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。
10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
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11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。
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6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。
8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；
9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出；
3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已
细胞传代培养
1细胞传代准备工作1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。
1.2细胞传代材料，滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。
2细胞传代步骤2.1人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。
2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右，关闭超净工作台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
2.4超净工作台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
2.5贴壁细胞的传代2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。
2.5.2酌情可用2～3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。
2.5.3以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。
2.5.4在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终至消化。
2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终至消化。
2.5.6用弯头滴管，吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。
2.5.7计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7～10ml／大瓶，3～5 mL ／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来，把细胞悬浮液加入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.2把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.4把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
传代细胞培养
合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM 、RPMI-1640、 DMEM等。
主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机 盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本 低 缺点：只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生 长。使用时还要添加一定比例的天然培养基。例 如血清。
1、培养细胞生长的条件
细胞的营养需要 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 无毒 无污染
培养基
天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液 优点：营养成分丰富，培养效果好
血清的成分
血清中含有： ①多种蛋白质（球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分 缺点： （1）来源受限。 （2）成分复杂，影响对某些实验产物的提取和 实验结果的分析。 （3）易发生支原体污染
可分为原代和传代培养两种方式。
知识简介：
贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。大部分二倍体 动物细胞。 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见 于各种造血系统肿瘤细胞
原代培养
从体内取出细胞接种培养到第一次传代的 阶段，叫原代培养。 方法：无菌操作取出组织（或器官） 酶消化处理 分散成单个细胞 培养 使其不断地生长和繁殖。
五、作业
1、简述动物细胞传代培养的注意事项？
实验中所用溶液的配制：
D-Hanks工作液试剂配方 氯化钠 8g 磷酸氢二钠（Na2HPO4 〃12H2O） 0.132g 氯化钾 0.4g NaHCO3 0.35g D-葡萄糖 1g 0.1% 酚红液 1ml 三蒸水 800ml ，溶解后定容到1000ml。 113 ℃灭菌15min。 消化液：胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D－ hanks配臵。 常用的浓度是0.25％ 。PH7.4用 滤器过滤除菌。 培养基：1640培养基（含10%小牛血清）
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费求：
掌握无菌操作技术。 了解传代细胞的培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解培养液配制方法。 了解倒置显微镜的使用。
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2
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实验原理：
细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单
细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、
繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分
配制培养液需要滤菌装置：除菌器、真空 泵以及0.45μm或0.22 μm的滤膜。
培养液应贮藏在4°C冰箱中。
配好的培养液应在无抗菌素的无菌条件下 进行培养，每次配好后留样，培养72小时， 观察培养液确实没有污染后使用。
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学习传代细胞的培养技术
本次试验应用HeLa细胞或A375-S2细胞 进行传代培养。
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（3）使用超净台的方法，在每次使用前，应用紫外 灯照30分钟。首先打开吹风的开关，在关掉紫外 灯，打开日光灯。点燃酒精灯，开始操作。
（4）超净台表面的处理。
a. 应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其 它液体及时被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌 繁殖的目的。
b. 工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他 非必须物应当除去。
目前，动物细胞培养技术已经达到一个新的阶 段：从不同分化组织衍生得到的许多类型的细 胞能够成功地在培养液中生长、反复传代。在 维持一个独特细胞系长达数月的过程中，记录 下细胞的倍增次数和生长速率是很有用的，以 便在合适的时间传代以及在体外生活是中不同 时间冻存细胞。
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5
实验内容：
1.工作环境及表面的处理（超净台的使用）
装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。
细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。 切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源， 更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方 式及入人体，可能对研究人员造成伤害。
细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应扣在工作台 上。
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如果培养的细胞已经被污染，切勿直接倒掉，应高 压灭菌后倒掉处理。
不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡 在70%乙醇中进行消毒，并在超净台上 吹干。
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3.实验者的操作技术
无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿， 细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。
细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作 间里进行。
培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开。
可以向培养液中加入抗生素，比如青霉素， 链霉素，庆大霉素等，抑制由于操作中的微 小失误而导致的低水平的感染。但是，有时 由于抗生素的加入，也会使感染不易被迅速 发现。
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培养液的配制：
商家一般以三种形式提供培养液：1.粉末 剂 （需要实验着配制）2.浓缩装（用无菌 水稀释即可）3.无需进一步处理的工作液 形式。由于粉末剂是其中最便宜的一种， 一般实验室较多采用。
为了防止交叉污染，原则上超净台中应不同时进行 二种细胞系或细胞株的操作。
不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培 养箱中不予理睬。
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4.细胞的处理以及维持细胞生长所需培
养液的无菌处理。
基本培养液由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡 萄糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血 清组成。一般用碳酸氢钠（NaHCO3)体系进行 缓冲。
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培养液的pH值应为7.2至7.4。
高密度细胞使细胞培养液中葡萄糖耗竭并产 生CO2和乳酸，在含酚红作为指示的培养液 中，培养液将从红色变为橙色。细胞培养液 长时间贮藏在4°C冰箱中，会使培养液的 pH值产生变化，变碱，是培养液的颜色呈深 品红紫色。应用时可用Hepes（N-2-羟乙基 哌嗪-N’-2-乙磺酸）调整。
* 早期细胞培养，依靠的是精湛的操作技术和尽可能的靠 近火焰一达到细胞的无菌化。
* 目前，超净台是使工作台无菌化最经济有效的手段。
（1）超净台的选择，应选择层流超净台。不能选择平流 超净台。超净台应该尽可能的安装紫外灯。
（2）超净台的维护，超净台的HEPA过滤层应该每一年 或一年后由认可的机构进行维修。
c. 日常的清洁工作包括：用70%的酒精或10%的 新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。
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2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理
用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶， 细胞培养板，吸管，各种瓶子等。
目前，上述器材均可以从商家买到无菌一 次性的用品。但是，成本太高。
玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以 反复使用。
细胞的生长不仅产生CO2，也需要CO2才能生存。 所以，细胞的培养需要子在CO2培养箱中
CO2培养箱中CO2的浓度应与培养液中碳酸氢钠 平衡。如果CO2的浓度为5%，则配培养液中应 加入1.97g/L的碳酸氢钠。
培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证 气体的交换。
培养液的pH值应为7.2至7..4。
裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，
死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染
色体，分析外界因素（如理化因素）对细胞的
影响，研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础
上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术
及单克隆抗体技术。
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动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。直 接从有机体获取的细胞进行的培养是原代培养， 若将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行 在培养叫做传代培养。
HeLa 细胞：人子宫颈癌细胞株 A375-S2细胞：人黑色素瘤细胞株
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操作前的准备（超净台内物品摆放）
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实验材料：
每组的超净台中有以下物品： 1. 20mlRPMI1640培养液1瓶；1-2ml小牛
血清（FCS) 1瓶；2ml胰蛋白酶 1瓶；1ml 谷氨酰胺 1瓶；1ml Hepes 1瓶；PBS(-)1 瓶 2. 1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个 镊子1把，小烧杯1个；酒精灯1台； 培养好细胞的细胞培养瓶1个
湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的 托盘提供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导 致各种细菌和真菌的污染，这种污染还可能存在与 培养箱壁上和提供气体的管道上。应该定期对培养 箱进行加热处理。也可以采用70%乙醇擦洗表面， 并定期更换输送CO2管道，并将该管子浸泡与 20%的含氯漂白剂中消毒。