蛋白质基础及检测技术

鉴定方法：常用圆二色谱法(Circular dichroism,CD)
圆二色谱法
圆二色光谱仪通过测量生物大分子的圆二色光谱从而得到生物大分子
的二级结构。当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时，由于介质中同 一种旋光活性分子存在手性不同的两种构型，故它们对平面偏振光所分 解成的右旋和左旋圆偏振光吸收不同，从而产生圆二色性。远紫外的圆 二色谱可用来测定蛋白质的二级结构，近紫外的圆二色谱可用来检测蛋 白质侧链的三级结构。 应用： 蛋白质折叠、蛋白质构象研究，DNA/RNA反应，酶动力学，光学活
5.2.2 蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构：是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠
方式。形成蛋白质二级结构基础的是肽单元或肽键平面。 蛋白质的二级结构主要依靠氢键来维持结构的稳定性。 常见的二级结构元件： α-螺旋 β-折叠
β-转角 β-折叠
β-转角
β-凸起 无规则卷曲
α-螺旋 无规则卷曲
蛋白质的一级结构包括： 组成蛋白质的多肽链数目； 多肽链的氨基酸顺序； 多肽链内和链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功 能的基础。 测定蛋白质一级结构的主要意义： 一级结构是研究高级结构的基础； 可以从分子水平阐明蛋白质的结构和功能的关系； 可为生物进化提供理论依据； 可为人工合成蛋白质提供序列参考。 目前可以运用氨基酸自动分析仪和质谱对蛋白质的一 级结构进行测定。
蛋白质基础及检测技术
1 蛋白质的基本概念
蛋白质（protein ）是生命的物质基础，是有机大分子， 是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没 有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。
2 蛋白质的元素组成
蛋白质不仅在功能上与糖、脂肪不同，在元素组成上 亦有差别。 根据蛋白质的元素分析表明，其元素组成依次为：碳 (50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19% ）、氢（6-7%） 硫（0-4%）。有的还含有少量磷、铁、铜、锌、锰、钴、 钼、碘等元素。一切蛋白质皆含有氮并且大多数蛋白质含 氮量比较接近而恒定，一般为15—17％，平均为16％。这 是蛋白质元素组成的一个重要特点，也是各种定氮法测定 蛋白质含量的计算基础。即用定氮法测得的含氮量乘以 6 ．25，即可算出样品中蛋白质的含量。但有的蛋白质中 氮的含量有一定差别，应根据其氮的真实含量进行计算。
3.3.2 紫外吸收性质
20种氨基酸在可见光区无吸收。在远紫外区：＜ 220nm都有光吸收。在近紫外光区（220-300nm）只有苯 丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收；色氨酸、酪氨酸的最大 吸收峰都在280nm附近。 由于大多数蛋白质中含有色氨酸和酪氨酸残基，所以 可以测定蛋白质溶液的280nm的光吸收值对蛋白质进行定 量分析。
各种氨基酸在结构上有下列共同特点： 组成蛋白质的氨基酸皆为α-氨基酸。
不同的α-氨基酸，其R侧链不同（氨基酸分类的依据）。它对蛋 白质的空间结构和理化性质有重要的影响。 除R侧链为氢原子的甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子所连接的 四个原子或基团互不相同，该碳原子都是不对称碳原子。 20种氨基酸中的脯氨酸含有亚氨基，所以它是亚氨基酸。半胱 氨酸在蛋白质分子中多数是以胱氨酸的形式存在。
氨基酸序列分析一般采用综合的方法测定目标制品的氨基酸序列，并与其基因序列 推断的理论氨基酸序列进行比较。
自动序列分析仪测序
其原理为Edman降解法，分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步 骤。首先在pH9.0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和 蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三 氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的 N一端第一个肽键选择性的 切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物；随后萃取出释放的氨基 酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；
蛋白质分子内各个原子之间相互的立体关系就是蛋白 质分子的结构。通常将蛋白质的结构分为一级结构、二级 结构、三级结构和四级结构。 5.2.1 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构：又称为初级结构或化学结构 ,是指蛋 白质分子中,由肽键连接起来的各种氨基酸的排列顺序。每 种蛋白质都有唯一而确切的氨基酸序列。 一级结构的主要化学键是肽键，有些还包括二硫键（-S-S）。因共价键的键能大，故蛋白质的一级结构稳定性较强。
5.2.4 蛋白质的四级结构
蛋白质的四级结构：具有三级结构的蛋白质分子 ,通过一 些非共价键结合起来 ,而成为具有生物功能的蛋白质大分 子,就是蛋白质的四级结构。 亚基：是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结 构的多肽链。亚基虽然具有二、三级结构 , 但是在单独存 在时并没有生物活力 ,只有完整的四级结构才具有生物活 力。 维系蛋白质四级结构的是氢键、盐键、范氏引力、疏水作 用等非共价键。
3.3 氨基酸的理化性质
3.3.1 两性解离及其等电点
氨基酸是两性电解质： 氨基酸既含羧基,又含氨基,同时能起酸和碱的作用，是 两性电解质，在水溶液中主要以兼性离子（偶极离子）的 形式存在。 氨基酸的等电点： 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阴、阳离子的趋势和 程度相等而成为兼性离子，呈电中性时溶液的pH称为该氨 基酸的等电点（isoelectric point，pI）。
C端测序
众所周知，C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位，对
蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。此外，由于蛋白翻译后在细胞 内需要进一步剪切和修饰，通常不能简单的使用基因序列对C-端或N 端做简单的预测，对于蛋白生物制品来说，使用C-端测序必不可少， 随着蛋白质组学研究的不断深入，蛋白质C端测序对其功能研究将发 挥越来越重要的作用。一些新的蛋白质 C端测序方法已建立，提高了 灵敏度和重复性，能够在蛋白质组水平应用。 方法：羧肽酶法、化学法及串联质谱法。 目前，使用较多的是利用串联质谱法，其原理为利用蛋白质在质谱 中有规律的破碎，获得蛋白质肽段的碎片，分析图谱得到蛋白质的C端序列。
N端测序
几乎所有的蛋白合成都起始于N-端，蛋白质N-端的序列组成对于蛋白质整 体的生物学功能有着巨大的影响力。例如N-端序列影响蛋白质的半衰期，同 时关联着蛋白亚细胞器定位等，这些与蛋白的功能和稳定性息息相关，对蛋 白进行N-端测序分析，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生 物学功能。 方法： 目前对蛋白N端测序主要分类两大类，其一为非质谱技术，例如经典的 Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋 白序列；其二为质谱技术。各自都有其使用的长处和制约之处，目前，市面 上采用的，依然是基于经典的Edman降解法原理，利用美国ABI公司 Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N-端测序。 原理：Edman化学降解，其基本原理是包括通过异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的 N- 端残基的偶联，苯氨基硫甲酰酞（ PTC- 肽）环化裂解，和噻唑呤酮苯氨 （ATZ）转化为苯异硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三个主要的化学步骤，每个 循环从蛋白质与多肽裂解一个氨基酸残基，同时暴露出新的游离的氨基酸进 行下一个Edman降解，最后通过转移的PTH-氨基酸鉴定实现蛋白质序列的测 定。
血红蛋白空间结构
蛋白质高级结构的实验解析方法
蛋白质结构实验分析主要有 三大技术பைடு நூலகம்台
（1）X-衍射蛋白质晶体结构分析 （2）核磁共振波谱分析 （3）冷冻电镜技术
蛋白质晶体结构X-衍射分析
是目前分辨率最高的结构测定方法，高通量晶体 结构分析中的几大重要环节是：数据处理与分析 、重原子的定位、密度修饰、分子替换、图形整 合、模型加工和确认。
3 蛋白质结构的基本单位—氨基酸
3.1 氨基酸的结构
自然界的氨基酸超过300种，但是组成人体蛋白质的氨 基酸有20种，可以看作是羧酸分子中α-碳原子上的氢原子 被氨基取代而成的化合物，均属于α-氨基酸，即其氨基和 羧基都连接在α-碳原子上。 氨基酸碳链表示： 其结构可用下列通式表示：
注：R代表不同的侧链基团，R不同 代表不同的氨基酸
性物质纯度测量，药物定量分析。天然有机化学与立体有机化学，物理
化学，生物化学与宏观大分子，金属络合物，聚合物化学等相关的科学 研究。
5.2.3 蛋白质的三级结构
蛋白质的三级结构：是指具有二级结构的肽链,按照一定方 式再进一步卷曲、盘绕、折叠成一种看来很不规则,而实际 上有一定规律性的三维空间结构。 维系三级结构的化学键主要是非共价键（次级键），如疏 水作用、氢键、盐键、范氏引力等，但也有共价键，如二 硫键等。
5 蛋白质的三维结构
5.1 稳定蛋白质的作用力
蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的，具有 特定分子结构的高分子化合物。蛋白质的分子结构可人为划 分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、 三、四级结构均属于空间结构，即构象。蛋白质的构象通常 由非共价键（次级键）来维系。
5.2 蛋白质的结构
3.2 氨基酸的分类
根据侧链R基团的结构和性质进行分类：
1）酸性氨基酸——谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp 其R基团含羧基，在pH7时，羧基可解离而使分子带负电荷。游离 或在蛋白质中都带负电荷，以酸根形式存在。在蛋白质中与正电基团 形成盐键。 2）碱性氨基酸——赖氨酸Lys、精氨酸Arg和组氨酸His 其R基团含碱性基团，在pH7时，这些基团可质子化而使分子带正 电荷。 3）非极性疏水性氨基酸 其R基团无极性、不解离，且为疏水性的。 4）不解离的极性氨基酸（极性非电离氨基酸）——羟基氨基酸+巯基氨 基酸+甘氨酸 其R基团虽有极性但不能解离。 5）蛋白质中少见的氨基酸——无遗传密码，来自翻译后加工修饰。
最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽
N端序列信息。
质谱技术
质谱所使用的测序方法是denovo测序, 是根据肽段与惰性气体相碰撞产 生的一系列的有规律的片段离子之间的质量差来推断氨基酸序列。我们可 以根据肽键断裂处的y离子和b离子来推测氨基酸序列从而不受翻译后修饰 和纯度的限制，但是质谱测序是有局限性的，1. 质谱测序依赖于公共数据 库。 如果所研究的物种的基因组没有完全被测序，或者其中部分没有对应
3.3.3 茚三酮反应
氨基酸与茚三酮水合物共热生成蓝紫色化合物，在 570nm处有最大吸收峰，可以作为定量测定氨基酸的方法。
4 肽
4.1 肽键
一个氨基酸的 α-羧基与另一个氨基酸的 α- 氨基脱水缩 合形成的共价键（ -CO— NH- ）称为肽键，又称酰胺键。 蛋白质分子中的氨基酸通过肽键连接。
4.2 肽
摸索蛋白质结晶条件、快速处理晶体结构数据和 减少差错是目前蛋白质晶体结构分析的两大难题 或瓶颈。
晶体结构分析的常用软件有SOLVE，RESOLVE等。
核磁共振波谱分析
氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为肽。
4.3 氨基酸残基（residue）
氨基酸在形成肽链后，因有部分基团参加肽键的形成，已经不是 完整的氨基酸，故将蛋白质肽链中的每个氨基酸部分称为氨基酸残基。
每一个氨基酸残基上都有一个R侧链，不同R侧链有不同的性质和 功能。 多肽链有两端： 具有游离α-氨基的称为氨基末端（N-末端，amino terminal），通 常写在肽链的左端。 具有游离α-羧基的称为羧基末端（C-末端，carboxyl terminal），常 写在肽链的右端。 多肽链的方向从N-端到C-端，肽链也是从N-端到C-端按氨基酸残 基的顺序来命名的。
的序列， 那么质谱测序将无法得出正确的鉴定。2. 我们使用的搜索引擎的
打分和算法可能也会使得我们遗漏一部分的肽段和质谱图的匹配， 产生假 阳性结果。3. 如果有点突变或者未知修饰存在的话， 由于搜库算法或者参
数设置中没有考虑到， 同样也无法得出正确的结果。
质谱技术还广泛用于蛋白质的纯度鉴定、分子质量测定、肽(质)谱分析、 二硫键、乙酰化、糖基化、磷酰化，以及非共价结合等。