实验六 硫化氢(H2S)含量的测定
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实验六 硫化氢（H2S） 含量的测定
（第六组：杨如春、农春响、李太蓉、陈登卫、何再炳）
I 二六硝基苯甲酸法 1.实验原理
硫化氢（H2S）目前被认为是植物中一种新的信 号分子，参与植物细胞的氧化还原平衡等多种生理 过程。H2S易溶于水，1molH2S与1mol二六硝基苯甲 酸（DT-NB）反应后，形成2mol黄色产物——硫硝基 苯甲酸，此物质在412nm处有最高吸收峰，并且在此 波长处的毫摩尔吸光系数为£412=27.2Lmmol-1.cm-1， 因此可根据硫硝基苯甲酸生成的量来计算植物组织 中H2S的含量。实验中常用的H2S供体有NaHS、Na2S、 GYY4137等，它们溶于水后可释放出H2S，H2S在水中 溶液中常解离为H+、HS-、S2-。
5.注意事项
离心后的上清液应定容到一个准确的体积，以便于含量 的计算。
2.材料、仪器设备及试剂
(1)材料 取热激0h、热激4h并恢复4h和高 温胁迫17h的玉米幼苗。 (2)仪器设备 紫外可见分光光度器，高 速冷冻离心机，微量加样器，分析天平，水 浴锅，研钵，量筒，吸量管，刻度试管，试 管架，容量瓶，药勺。 (3)试剂 H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓 冲溶液(ph7.4)，内含10mmol/LEDTA和0.25% 醋酸锌)；50 mmol/L FeCl3(用1.2 mol/L HCl 配置)；5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(用 7.2mol/L HCl配置)；10μ mol/LNa2S。
再加入40µL20mmol/L DTNB ，再摇匀2min 于412nm处测定吸光度A412
以NaHS浓度为横坐标，A412为纵坐标，建立标准曲线或回归方程
4.结果计算
从标准曲线中查找出相应的H2S浓度，用µmol/g 表示H2S含量。 H2S含量（µmol/g）=C/w×(Vt/1000) 式中：C为标准曲线上查出的H2S浓度； Vt为提取液的总体积，即1mL； W为材料的鲜重（g）。
5.实验注意事项
(1)离心后上清液应定容到一个准确的体积，以 便于含量计算。 (2)实验中，应严格控制DTNB的用量。
Ⅱ亚甲蓝法
1.实验原理
在FeCl3(作为氧化剂)存在的强酸性条件下，硫 化氢(H2S)与N,N-二甲基对苯二胺反应生成蓝色的亚 甲蓝，亚甲蓝在667nm处有最大吸收,故可根据亚甲 蓝生成的量来计算植物组织中H2S的含量。此法专一 性和灵敏性好，检测极限低于 5μ mol/L,理想条件 下可达到 10 nmol/L。
2.材料、仪器设备及试剂
(1)材料 取热激0h、热激4h并恢复4h和高温胁 迫17h的玉米幼苗。 (2)仪器设备 紫外可见分光光度器，高速冷冻 离心机，微量加样器，分析天平，水浴锅，研钵， 量筒，吸量管，刻度试管，试管架，容量瓶，药勺。 (3)试剂 H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓冲溶 液(ph7.4)，内含10mmol/LEDTA和0.25%醋酸锌)；50 mmol/L FeCl3(用1.2 mol/L HCl配置)； 5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(用7.2mol/L HCl配置)；10μ mol/LNa2S。
3.实验步骤
(1)H2S的提取
热激0h(热激 前)黄化玉米 幼苗
热激4h并恢复 48℃高温胁迫 4h黄化玉米幼 17h黄化玉米 苗 幼苗
0.5g 0.5g 0.5g 加预冷的提取液1mL和少许石英砂，充分冰浴 研磨 转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上 清液
(2) H2S的测定
2.4mL
2.4mL
2.4mL
加入0.3mL5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺，摇匀 加入0.3mL50mmol/L FeCl3，摇匀15min 于667nm处测定吸光度A667
(3)标准曲线的制作
10μmol/L Na2S（mL） 蒸馏水(mL) 0 2 4 6 8
10 0
10
8
6
4
2
各取2.4mL于6支试管中 加入0.3mL5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺，摇匀
取200µL上清液 加入提取液3760µL，摇匀 再加40µL20mmol/L DTNB ,摇匀2min
源自文库
于412nm处测定吸光度A412
(3)标准曲线的制作
10μ mol/L NaHS（mL） 0 2 4 6 8 10
蒸馏水(mL)
10
8
6
4
2
0
各取1mL于6支试管中
分别去200µL，加入提取液3760µL，摇匀
3.实验步骤
(1)H2S的提取
热激4h并恢复4h黄化玉 热激0h(热激前)黄化玉 米幼苗 米幼苗 48℃高温胁迫17h黄化 玉米幼苗
1g
1g
1g
加预冷的提取液3mL和少许石英砂，充分冰浴研磨
转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上清液
(2) H2S的测定
热激0h(热激前)黄化玉米 幼苗上清液 热激4h并恢复4h黄化 玉米幼苗上清液 48℃高温胁迫17h黄 化玉米幼苗上清液
加入0.3mL50mmol/L FeCl3，摇匀15min
于667nm处测定吸光度A667
以Na2S浓度为横坐标，A667为纵坐标，建立标准曲线或回归方程
4.结果计算
从标准曲线中查出相应的H2S浓度，求H2S的含量 (μ mol/g)。公式如下： H2S的含量(μ mol/g)=(C/ω )×(Vt/1000) 式中：C为标准曲线上查出的H2S浓度； Vt为提取液的总体积，即3mL； ω 为材料的鲜重。
（第六组：杨如春、农春响、李太蓉、陈登卫、何再炳）
I 二六硝基苯甲酸法 1.实验原理
硫化氢（H2S）目前被认为是植物中一种新的信 号分子，参与植物细胞的氧化还原平衡等多种生理 过程。H2S易溶于水，1molH2S与1mol二六硝基苯甲 酸（DT-NB）反应后，形成2mol黄色产物——硫硝基 苯甲酸，此物质在412nm处有最高吸收峰，并且在此 波长处的毫摩尔吸光系数为£412=27.2Lmmol-1.cm-1， 因此可根据硫硝基苯甲酸生成的量来计算植物组织 中H2S的含量。实验中常用的H2S供体有NaHS、Na2S、 GYY4137等，它们溶于水后可释放出H2S，H2S在水中 溶液中常解离为H+、HS-、S2-。
5.注意事项
离心后的上清液应定容到一个准确的体积，以便于含量 的计算。
2.材料、仪器设备及试剂
(1)材料 取热激0h、热激4h并恢复4h和高 温胁迫17h的玉米幼苗。 (2)仪器设备 紫外可见分光光度器，高 速冷冻离心机，微量加样器，分析天平，水 浴锅，研钵，量筒，吸量管，刻度试管，试 管架，容量瓶，药勺。 (3)试剂 H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓 冲溶液(ph7.4)，内含10mmol/LEDTA和0.25% 醋酸锌)；50 mmol/L FeCl3(用1.2 mol/L HCl 配置)；5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(用 7.2mol/L HCl配置)；10μ mol/LNa2S。
再加入40µL20mmol/L DTNB ，再摇匀2min 于412nm处测定吸光度A412
以NaHS浓度为横坐标，A412为纵坐标，建立标准曲线或回归方程
4.结果计算
从标准曲线中查找出相应的H2S浓度，用µmol/g 表示H2S含量。 H2S含量（µmol/g）=C/w×(Vt/1000) 式中：C为标准曲线上查出的H2S浓度； Vt为提取液的总体积，即1mL； W为材料的鲜重（g）。
5.实验注意事项
(1)离心后上清液应定容到一个准确的体积，以 便于含量计算。 (2)实验中，应严格控制DTNB的用量。
Ⅱ亚甲蓝法
1.实验原理
在FeCl3(作为氧化剂)存在的强酸性条件下，硫 化氢(H2S)与N,N-二甲基对苯二胺反应生成蓝色的亚 甲蓝，亚甲蓝在667nm处有最大吸收,故可根据亚甲 蓝生成的量来计算植物组织中H2S的含量。此法专一 性和灵敏性好，检测极限低于 5μ mol/L,理想条件 下可达到 10 nmol/L。
2.材料、仪器设备及试剂
(1)材料 取热激0h、热激4h并恢复4h和高温胁 迫17h的玉米幼苗。 (2)仪器设备 紫外可见分光光度器，高速冷冻 离心机，微量加样器，分析天平，水浴锅，研钵， 量筒，吸量管，刻度试管，试管架，容量瓶，药勺。 (3)试剂 H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓冲溶 液(ph7.4)，内含10mmol/LEDTA和0.25%醋酸锌)；50 mmol/L FeCl3(用1.2 mol/L HCl配置)； 5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(用7.2mol/L HCl配置)；10μ mol/LNa2S。
3.实验步骤
(1)H2S的提取
热激0h(热激 前)黄化玉米 幼苗
热激4h并恢复 48℃高温胁迫 4h黄化玉米幼 17h黄化玉米 苗 幼苗
0.5g 0.5g 0.5g 加预冷的提取液1mL和少许石英砂，充分冰浴 研磨 转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上 清液
(2) H2S的测定
2.4mL
2.4mL
2.4mL
加入0.3mL5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺，摇匀 加入0.3mL50mmol/L FeCl3，摇匀15min 于667nm处测定吸光度A667
(3)标准曲线的制作
10μmol/L Na2S（mL） 蒸馏水(mL) 0 2 4 6 8
10 0
10
8
6
4
2
各取2.4mL于6支试管中 加入0.3mL5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺，摇匀
取200µL上清液 加入提取液3760µL，摇匀 再加40µL20mmol/L DTNB ,摇匀2min
源自文库
于412nm处测定吸光度A412
(3)标准曲线的制作
10μ mol/L NaHS（mL） 0 2 4 6 8 10
蒸馏水(mL)
10
8
6
4
2
0
各取1mL于6支试管中
分别去200µL，加入提取液3760µL，摇匀
3.实验步骤
(1)H2S的提取
热激4h并恢复4h黄化玉 热激0h(热激前)黄化玉 米幼苗 米幼苗 48℃高温胁迫17h黄化 玉米幼苗
1g
1g
1g
加预冷的提取液3mL和少许石英砂，充分冰浴研磨
转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上清液
(2) H2S的测定
热激0h(热激前)黄化玉米 幼苗上清液 热激4h并恢复4h黄化 玉米幼苗上清液 48℃高温胁迫17h黄 化玉米幼苗上清液
加入0.3mL50mmol/L FeCl3，摇匀15min
于667nm处测定吸光度A667
以Na2S浓度为横坐标，A667为纵坐标，建立标准曲线或回归方程
4.结果计算
从标准曲线中查出相应的H2S浓度，求H2S的含量 (μ mol/g)。公式如下： H2S的含量(μ mol/g)=(C/ω )×(Vt/1000) 式中：C为标准曲线上查出的H2S浓度； Vt为提取液的总体积，即3mL； ω 为材料的鲜重。