microRNA快速提取试剂盒
慢病毒颗粒RNA提取试剂盒
M 12 34 5678 9 + - M
1% Agarose 凝胶电泳图 M：100 bp DNA Ladder（Dye Plus） 1.2：HL60 细胞培养液中 HAV 检测结果 3.4：全血中 HAV 检测结果 5.6：唾液中 HAV 检测结果 7.8：尿液中 HAV 检测结果 9：小鼠肝脏中 HAV 检测结果 +/-：正负对照(Code No. RR024)
实验材料
直接裂解或液氮研磨 加 Buffer VGB、Proteinase K 和 Carrier RNA 56℃温浴
裂解液
向裂解液中加无水乙醇 溶液移至 Spin Column 中
弃滤液
Buffer RWA 清洗 Spin Column
Buffer RWB
2. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，溶液移至 Spin
页码
1 1 1 1 2 3 4 4 4
● 制品说明
本试剂盒是专门用于从血浆、全血、无细胞体液、病毒原液和感染病毒的组织中提取各种病毒（Virus） RNA/DNA 的小量纯化试剂盒。试剂盒采用了独特的病毒裂解系统，由病毒裂解液裂解病毒释放 RNA 或 DNA，再结合核酸制备膜技术纯化 RNA 或 DNA，适用于各种 RNA 或 DNA 病毒的核酸提取。本试剂盒 具有高效、快速、方便之特点，病毒裂解后，提取操作仅需 20 分钟便可完成。本试剂盒配有 Carrier RNA 可提取样品中微量的 RNA/DNA。使用本试剂盒可从低至 1.0E+04 copies 的甲肝病毒或 1.6E+05 copies 的 flury 株狂犬病毒中提取得到 RNA，所得 RNA 可通过 RT-PCR 进行检测。提取得到的 RNA 可用于 RT-PCR 反应、Northern 杂交等多种分子生物学实验。
rna提取试剂盒原理
rna提取试剂盒原理RNA提取试剂盒是用于从细胞或组织样品中提取RNA的一种化学试剂盒。
RNA提取是分子生物学和基因表达研究的重要步骤之一，能够有效地分离RNA并去除DNA、蛋白质和其他杂质。
本文将详细介绍RNA提取试剂盒的原理。
一、RNA提取试剂盒的组成RNA提取试剂盒主要由以下几个部分组成：1. 细胞裂解缓冲液：用于破坏细胞膜和核膜，释放出细胞内的RNA。
2. 溶解液：用于溶解破坏后的细胞和组织样品中的核酸。
3. 酚/氯仿：用于分离RNA。
4. 筛选柱：用于去除DNA、蛋白质和其他杂质。
5. 洗涤缓冲液：用于洗涤筛选柱，去除残留杂质。
6. 去离子水：用于洗涤筛选柱后洗脱纯化后的RNA。
二、RNA提取试剂盒的原理1. 细胞裂解首先，需要将样品中的细胞或组织裂解，释放出RNA。
细胞裂解缓冲液中包含有破坏剂，如SDS和EDTA等，能够破坏细胞膜和核膜，并释放出细胞内的RNA。
2. 核酸溶解经过细胞裂解后，需要将样品中的核酸溶解。
溶解液中含有高浓度的盐和pH调节剂，能够使DNA和RNA分子变性并溶于水相中。
3. RNA分离接下来，需要将RNA与DNA、蛋白质和其他杂质分离。
酚/氯仿是一种常用的分离试剂，可以将RNA从DNA、蛋白质和其他杂质中分离出来。
酚/氯仿具有不同的密度，在试管中形成两个不同层次的相，上层为水相（含有RNA），下层为有机相（含有DNA、蛋白质和其他杂质）。
这样就可以通过移液器或吸管将上层水相取出。
4. RNA纯化虽然通过酚/氯仿可以将RNA分离出来，但仍然存在一些杂质。
因此需要进行纯化步骤。
筛选柱中含有硅胶或磁性珠等材料，能够吸附RNA并去除DNA、蛋白质和其他杂质。
经过洗涤缓冲液的洗涤后，去离子水可以将纯化后的RNA从筛选柱中洗脱。
三、RNA提取试剂盒的应用RNA提取试剂盒广泛应用于基因表达研究、分子生物学和遗传学等领域。
例如，可以用于分离不同组织或细胞类型中的RNA，并进行基因表达谱分析；也可以用于研究基因转录调控机制等。
miRNA高效检测方法及具体步骤
miRNA高效检测方法及具体步骤miRNA（microRNA）是一类长度约为22个核苷酸的小分子RNA，它在生物体内起到调节基因表达的重要作用。
由于miRNA在许多生物学功能中的重要性，开展高效检测miRNA的方法具有很大的研究价值。
目前，有许多方法可以用于检测miRNA，本文将介绍其中几种常见的方法及其具体步骤。
1.基于荧光探针的实时定量PCR法实时定量PCR (qPCR) 是一种常见且广泛应用的方法，可以用于miRNA的检测。
该方法在miRNA的检测过程中，首先将miRNA转录为cDNA，然后通过PCR反应扩增miRNA的序列。
在qPCR中，miRNA将与一个标记有荧光探针的引物结合，通过荧光信号的监测，可以对miRNA的数目进行定量分析。
具体步骤如下：- 步骤一：RNA提取：使用RNA提取试剂盒将miRNA从细胞或组织样本中提取出来。
- 步骤二：miRNA逆转录：使用miRNA逆转录试剂盒将miRNA逆转录为cDNA。
- 步骤三：qPCR扩增：使用qPCR试剂盒对miRNA的cDNA进行PCR扩增。
- 步骤四：数据分析：通过检测PCR产物的荧光信号，计算miRNA的表达量。
2. Northern blotting法Northern blotting是一种传统的RNA分析方法，也可以用于miRNA的检测。
在该方法中，首先将miRNA与若干硝酸酰胺交联，并通过琼脂糖凝胶电泳分离miRNA。
然后，将miRNA转移到膜上，并使用与miRNA互补的探针进行杂交。
通过放射性或化学染料检测标记的探针与miRNA的结合，可以确定miRNA的存在与周围环境的定量。
具体步骤如下：- 步骤一：miRNA分离：使用硝酸酰胺交联和电泳方法从总RNA中分离miRNA。
- 步骤二：膜转移：将miRNA转移到膜上。
- 步骤三：杂交：使用与miRNA互补的标记探针进行杂交。
- 步骤四：探针检测：通过放射性或化学物质检测标记的探针与miRNA的结合来确定miRNA的存在。
Micro 试剂盒RNA提取步骤 Qiagen
在滤液中加入Y体积的70%酒精，混合均匀后，转入RNeasy MinElute spin column中，10,000 rpm离心15 s。
Step-4
弃滤液，加入700μL Buffer RW1至吸附柱中，10,000 rpm离心15 s。
Step-5
弃滤液，加入500μL Buffer RPE至吸附柱中，10,000 rpm离心15 s。
Step-1
将收集螨（卵）轻轻用毛笔扫至研钵中，加入液氮进行研磨，待螨体（卵）被研碎至均匀粉末状后，加入350 μL裂解液并继续充分研磨，最后将研钵中组织混合液转移至1.5 mL离心管中。
Step-2
将组织混合液以最大转速（1,3000 rpm）离心3分钟，轻轻将上清液吸出，避免接触管底沉淀，将Y体积上清液转移至gDNA Eliminator spin colum中，并10,000 rpm转速离心将基因组DNA去除，此时保留滤液，丢掉过滤柱。
提取步骤
具体方法
前期准备
a.裂解液的配制：取1,600 μL Buffer RLT，加入16 μLβ-ME；
b.酒精的配制：取1,120 μL无水乙醇，加入480 μL Rnase-free water，即得70%酒精溶液，取1,920 μL无水乙醇，加入480 μL Rnase-free water，即得80%酒精溶液。
Step-9将每管总RNA分装 NhomakorabeaμL用于琼脂糖电泳和浓度测定，其余20μL放至超低温冰箱保存。
Step-10
琼脂糖电泳条件：1.0%琼脂糖凝胶，3 μL总RNA，150 V电压，电泳时间为10 min。
Step-11
核酸浓度及质量检测：取2μL总RNA，在核酸浓度测定仪上记录RNA浓度、A260/280和A260/230数据，判断总RNA纯度。
rna提取试剂盒原理
rna提取试剂盒原理标题：RNA提取试剂盒原理及其在分子生物学中的应用引言：RNA（核糖核酸）是生物体内的重要分子之一，它承担着转录和翻译过程中的信息传递和表达功能。
为了研究RNA的结构、功能和调控机制，科学家们发展了各种RNA提取试剂盒，通过这些试剂盒可以将RNA从生物样本中提取出来。
本文将重点介绍RNA提取试剂盒的原理及其在分子生物学研究中的应用。
一、RNA提取试剂盒的原理1. 细胞破碎与裂解：在RNA提取过程中，首先需要对细胞进行破碎和裂解，以释放细胞内的RNA。
这一步可以通过物理方法（如超声波处理、高压破碎）或化学方法（如细胞裂解缓冲液）来实现。
2. RNA的选择性结合：细胞裂解后，需要将RNA与其他细胞成分（如DNA、蛋白质）分离。
RNA提取试剂盒通常使用硅胶或磁珠等材料，通过其表面带有的亲和基团与RNA特异性结合，实现RNA的选择性分离。
3. 杂质的去除：在RNA分离过程中，还常伴随着DNA、蛋白质等杂质的存在。
为了获得纯度较高的RNA样品，RNA提取试剂盒会添加特定的缓冲液或柱子材料，能够去除这些杂质。
4. RNA的洗脱与回收：经过前面几步处理后，RNA会被特定的洗脱缓冲液溶解，并从材料表面或柱子中释放出来，最终得到高纯度的RNA可用于后续实验分析。
二、RNA提取试剂盒在分子生物学中的应用1. 基因表达分析：RNA提取试剂盒是进行基因表达分析的重要工具。
通过提取细胞或组织中的RNA，可以进一步通过定量PCR、实时荧光定量PCR或基因芯片等方法来测量特定基因的表达水平。
2. RNA测序：随着高通量测序技术的发展，RNA提取试剂盒在RNA 测序（RNA-seq）中的应用越来越广泛。
通过提取RNA，可以对全转录组进行测序，从而揭示基因的组成、结构和表达模式。
3. miRNA研究：miRNA（微小RNA）在基因调控中发挥着重要作用。
RNA提取试剂盒可以用于提取细胞或组织中的miRNA，并进一步研究其在疾病发生机制、肿瘤诊断和治疗等方面的功能。
快速提取RNA试剂盒的使用注意事项
快速提取RNA试剂盒的使用注意事项1、细胞数建议不超过300万，最多不超过500万，否则可能会堵塞离心柱。
当细胞数较多时（例如使用6cm dish），裂解后可以先12000g离心1分钟，然后取上清加等体积乙醇，充分混匀后上柱；2、如果加入乙醇后有显著的沉淀产生，则用枪吹打，将沉淀吹至看不见为止，然后上柱；3、4000g离心1分钟后，如果柱子中仍然有液体残留，可以用12000g离心；4、对于细胞量很少的样品，或者客户对RNA产量要求较高的情况：实验开始前可以先把洗脱液放到65度，加入洗脱液后，可以室温放置1~2分钟，使RNA充分溶解，然后离心，然后再将得到的RNA加入柱子中放置5分钟，重复洗脱一次。
5、洗脱液的体积不可太少或太多，建议通常加20~30微升洗脱液即可。
6、如果实验对极少量的基因组残留很敏感，可以在4000g离心后，用随试剂盒附赠的DNA 酶处理：每个样品的柱子中央加入12 ul稀释好的DNase（按照2 ul DNA酶+10 ul ddH2O的比例稀释，用枪吹打混匀）客户常问到的问题1、这个试剂盒能不能加入裂解液以后先冻存起来，等到样品都收集齐了再一起做？答：细胞样品可以加入裂解液后，充分混匀，vortex震荡使细胞充分裂解，然后冻存于-80度。
理论上能保存的时间跟TRIzol保存的时间相当。
2、这个试剂盒能提的最小细胞量是多少，组织最少能做多少？答：常规的细胞（如293T等及常见的细胞，如癌细胞等），最低5万个就可以提出RNA，更少的细胞数需要自己尝试做优化。
对于T、B细胞等免疫细胞，由于其体积远小于常规细胞（大约只有常规细胞的几十分之一），因此能提取的最低细胞数需要明显增加，最低需要100万以上。
3、关于组织RNA的提取，有什么需要注意的吗？答：本试剂盒提取细胞样品的RNA最简便，提取组织样品时有一定的局限，只能提取内脏组织、肿瘤组织等相对易于裂解的组织。
提取组织样品时，样品用量不可过多，建议用5mg 组织。
rna提取试剂盒原理
RNA提取试剂盒的基本原理RNA提取试剂盒是一种用于从生物样品中提取RNA的化学试剂盒。
它可以将细胞或组织中的RNA分离出来，以便后续的分子生物学研究，如逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时定量PCR、Northern blotting等。
下面将详细解释RNA提取试剂盒的基本原理。
1. 细胞破碎和裂解RNA提取试剂盒首先要对细胞或组织进行破碎和裂解，以释放内部的RNA。
这一步通常使用离心和化学方法来实现。
首先，通过离心将样品离心下来，去除上清液中的培养基或缓冲液。
然后，加入裂解缓冲液和蛋白酶K等蛋白酶来破坏细胞膜和核膜，并降解RNA酶。
裂解缓冲液中通常含有高浓度的盐和洗涤剂，以破坏细胞膜结构。
蛋白酶K能够降解核酸结合蛋白和核酸酶，从而保护RNA不被降解。
2. RNA的结合与纯化在细胞裂解后，RNA提取试剂盒通过添加特定的试剂和离心步骤来使RNA与其他杂质分离。
首先，加入乙酸酚/氯仿溶液，这种溶液可以使DNA和蛋白质沉淀到有机相中，而RNA则存在于水相中。
然后，通过离心将两个相分离开来。
DNA和蛋白质会沉淀到底部形成有机相，而RNA会存在于上层的水相中。
接下来，将水相转移到新的离心管中，并加入异丙醇。
异丙醇能够使RNA与水分子结合起来形成复合物，并沉淀下来。
然后再次进行离心分离，并去除上清液。
3. RNA的洗涤和去除污染物为了得到纯净的RNA样品，需要对沉淀下来的RNA进行洗涤和去除污染物。
首先，在沉淀下来的RNA上加入75%乙醇溶液进行洗涤。
乙醇能够使RNase失活，并帮助去除污染物。
然后通过离心将RNA沉淀下来，去除上清液。
接下来，重复洗涤步骤一次或两次，以进一步去除污染物。
4. RNA的溶解和保存最后一步是将纯化的RNA溶解在适当的缓冲液中，并保存起来以便后续实验。
通常使用无RNase的缓冲液（如DEPC水）来溶解RNA。
然后通过离心去除任何可能残留的杂质。
为了保护RNA不被降解，在提取过程中需要使用RNase抑制剂和无RNase的试剂。
RNA 提取试剂盒
RNA 提取试剂盒1、总RNA 提取试剂（TRI Reagent，RNA Isolation Reagent）TRI ® Reagent 是改进型的一步法细胞总RNA 纯化试剂。
它可以快速、经济、有效的提取人、动物、植物、酵母、细菌和病毒的总RNA。
也可以同时提取DNA 和蛋白质。
该产品含有硫氰酸胍和苯酚，能够有效溶解RNA，DNA 和蛋白质。
在加入氯仿并离心后，上层水相中含有RNA。
水相的RNA 经过沉淀和洗涤后几乎没有DNA 或者蛋白质污染，可以用于Northern blots、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 酶保护分析、克隆或者PCR 等等。
该产品可以有效分离0.1-15 kb 长度单位内的RNA 分子，每毫升TRI® Reagent 可以提取5-10×106细胞、50-100mg 组织或者10 cm 2培养瓶表面的单层培养细胞。
完全移走水相的离心产物加入无水乙醇沉淀DNA，用柠檬酸钠乙醇溶液洗涤，溶解后可用于PCR、限制性酶切以及Southern blotting 等。
沉淀DNA 后的水相加入异丙醇沉淀蛋白质，用盐酸胍乙醇溶液洗涤，分离的蛋白质可用于Western blotting 等。
优点：1）可用于多种组织：人、动物、植物、酵母、细菌和病毒。
2）提取大量或者少量的组织细胞效果良好。
3）比传统的硫氰酸胍/氯化铯方法产率高。
4）1 ml 最多可以提取107细胞或者100 mg 组织。
货号名称适用范围产品规格价格T9424TRI Reagent组织，培养细胞，细胞团25ml, 100 ml, 200ml506，1590，2860T3809TRI ReagentBD全血，血浆，血清25ml, 100 ml, 200ml536，1699，2978T3934 TRI Reagent LS 细胞悬浮液，脑脊液，羊水25ml, 100 ml, 200ml938，2603，43362、哺乳动物细胞总RNA 提取试剂盒（GenElute TM Mammalian Total RNA Miniprep Kits）该试剂盒结合了硅质膜技术和离心柱技术，可以快速结合、洗涤、溶解获得高质量的细胞总RNA。
血清血浆microRNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://Serum/Plasma microRNA Kit血清/血浆microRNA快速提取试剂盒目录号：RN46适用范围：适用于从动物及人体血浆和血清中纯化包括miRNA的无细胞总RNA。
试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次(RN4601)Lysis buffer 4°C避光50 mlWash Solution 1 室温12 ml第一次使用前加入28ml无水乙醇Wash Solution 2/3 室温10 ml第一次使用前加入42ml无水乙醇RNase-free H2O 室温10 mlRNase-free吸附柱RA和收集管室温50套本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。
储存事项：1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。
但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和异丙醇或者乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血清血浆样本更是由于其自身特点更难提取。
本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解血清血浆RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA在高浓度乙醇下吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法[发明专利]
![一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cfd831b2bdeb19e8b8f67c1cfad6195f312be813.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110200887.9(22)申请日 2021.02.23(71)申请人 山东思科捷生物技术有限公司地址 250000 山东省济南市中国（山东）自由贸易试验区济南片区新泺大街786号生产装配车间B座506(72)发明人 冯锐 任光琳 韩小东 程建祥 李昌静 (74)专利代理机构 青岛清泰联信知识产权代理有限公司 37256代理人 张洁(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法(57)摘要本发明提出一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法，属于分子生物学检测技术领域，该细胞RNA快速提取试剂盒包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱，所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris ‑HCl 0.01‑0.1M、N ‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)，所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris ‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。
本发明能够解决现有RNA提取方法存在操作步骤繁琐、耗时长、RNA纯度低且稳定性差等的技术问题。
本发明能够应用于RNA提取方面。
权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 112725334 A 2021.04.30C N 112725334A1.一种细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris ‑HCl 0.01‑0.1M、N ‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)；所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris ‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。
天漠科技RNA 小量提取试剂盒说明书
操作手册RNA小量提取试剂盒Catalog No. TR154-50 (50次反应)TR154-200 (200次反应)Highlights∙适用于从细胞，组织，酵母菌，植物或者细菌中提取到总RNA（含microRNA）。
∙提取到的RNA不含DNA,并可应用于Q-PCR，高通量测序等实验。
∙此产品仅供科研使用。
Ver.1.0.9北京天漠科技开发有限公司Tel: +86-10-58235289产品组成:50200 RNA裂解液室温50 ml 2 X 100 mlRNA预洗液室温25 ml 100 mlRNA洗涤液室温 24 ml 2 X 48 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇RNase-free H2O 室温 6 ml 30 mlDNase I DNA消化液-20℃室温250U X 1管 250U X 4管4 ml 16 ml3号柱G（绿色）室温50个200个3号柱Y(黄色)室温50个200个收集管（2ml）室温50个200个特性:1.样品来源：细胞，组织，酵母，植物或者细菌，兼容核酸保护剂。
2.样品范围：最多107细胞或50mg的组织。
3.RNA纯度：高质量的RNA可应用于高通量测序等敏感的下游实验。
4.RNA回收率：可从30μl洗脱体积中回收到100μg的RNA.试剂制备RNA洗涤液在使用之前一定要配好，添加好乙醇后在试剂瓶上做好标记！！！需要添加96ml100%的乙醇（或104ml95%乙醇）到24ml的 RNA洗涤液中需要添加192 ml 100% ethanol (208 ml 95% ethanol) 到48ml的 RNA洗涤液中试用装已经添加好无水乙醇，无需额外添加。
溶解冻干粉状态的DNase I需要按照管子上的量添加 RNase-free H2O一般250U的DNase I 需要添加275μl的RNase-free H2O操作步骤:整个操作步骤是由3个步骤组成：（I）样品裂解匀浆（I I）样品清理（I I I）样品纯化.所有步骤均在室温下操作（20-30℃）（I）样品裂解匀浆贴壁细胞去除液体培养基后，直接往培养板中加入RNA裂解液溶解细胞，并用移液枪轻轻吹打混匀。
赛默飞世尔TaqMan MicroRNA Assays 简要操作说明说明书
快速参考手册TaqMan MicroRNA Assays简要操作说明（Rev.A.0）本操作说明提供了TaqMan MicroRNA Assays的简要操作指南。
更详细信息，请至赛默飞世尔官方网站下载英文版说明书：https:///content/sfs/manuals/cms_042167.pdf一．配制反转录体系1.准备总RNA（1）注意：应选择适当的提取方法，避免提取过程中丢失microRNA（2）RNA定量2.准备反转录预混液（1）将Taqman MicroRNA反转录试剂盒中的组分放在冰上融化后涡旋混匀。
（2）准备一支无RNA酶的离心管，参照下表，在冰上配制反转录预混液。
组成成分反应体系100mM dNTPs(with dTTP)0.15µl反转录酶 1.00µl10X反转录buffer 1.50µlRNase抑制剂0.19µl无核酸酶H2O 4.16µl总体积7.00µl（3）涡旋混匀，离心。
（4）将反转录预混液放置在冰上备用。
3.配制反转录体系（1）在冰上将5x反转录引物和RNA模板融化。
涡旋混匀。
（2）15µl的反转录体系中，加入1-10ng RNA（5µl），7µl反转录预混液，3µl反转录引物，涡旋混匀，离心。
（3）将反应管放在冰上放置5分钟，然后进行反转录实验。
4.设置反转录步骤将反应管放入PCR仪内，按照下列的反应程序进行设置：模式：标准模式，反应体积：15µl阶段时间温度退火30分钟16°C延伸30分钟42°C失活5分钟85°C∞4°C2二．定量PCR 扩增1.准备定量PCR 反应体系（1）将反应用到的组分放在冰上融化，混匀后放置冰上备用。
（2）按照20µl 反应体系计算所需要的试剂量。
将各组分加入离心管中，涡旋混匀，离心。
microRNA快速提取试剂盒使用手册
1、组织处理：将组织于液氮内研磨，每50-100mg加1mL裂解液MRL后匀浆，组织样品容积不能超过MRL的10%；2、将匀浆剧烈混匀，在15-30℃条件下孵育5min，是核蛋白体完全分解；3、可选步骤：4℃的条件下12000rpm离心10min，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。
4、每1ML加0.2ml氯仿。
剧烈震荡15s，并将其在室温下孵育3min；5、于4℃12000rpm离心10分钟，样品会分3层，上层为水相，RNA存在于水相中，水相层的容量大约为锁甲MRL体积的60%，把水相转移到新管仲，进行下一步操作；6、加入0.6倍体积70%乙醇，混匀，转移至RA中；7、（10000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将混合液倒入RB中，每次最多700ul,10000rpm离心30秒弃掉废液。
）滤出小RNA.8、加入700ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液（下液）；9、加入500ul漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液（下液）；10、空液离心2min，1200rpm；11、取出吸附柱RB，放入RNase free离心管中，根据预期RNA产量，在吸附膜中间部位加入60-80ul，RNase free water事先在65-70℃水浴加热，室温放置2min，12000rpm 离心1min，收集得到microRNA,保存于-20摄氏度或更低。
1、组织+裂解液每50-100mg加1mL 15-30℃条件下孵育5min2、每1ML加0.2ml氯仿剧烈震荡15s，并将其在室温下孵育3min 4℃12000rpm离心10分钟3、把水相转移到新管仲加入0.6倍体积70%乙醇，混匀，转移至RA中4、（10000rpm离心45秒，收集下滤液，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀，将混合液倒入RB中，每次最多700ul,10000rpm离心30秒弃掉废液。
microrna磁珠手动提取
microrna磁珠手动提取介绍在分子生物学研究中，microrna（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子，它在基因表达调控中起着重要的作用。
研究人员常常需要从样本中提取miRNA，以便进行进一步的实验分析。
而microrna磁珠手动提取就是一种常用的提取方法，本文将详细介绍该方法的步骤和操作要点。
准备工作在进行microrna磁珠手动提取之前，我们需要准备以下材料和试剂： - miRNA提取试剂盒 - 样本（例如细胞、组织或体液） - miRNA磁珠 - 离心管和离心机 - 磁珠分离架步骤1. 样本处理首先，我们需要对样本进行处理，以使miRNA能够充分释放。
具体步骤如下： 1. 将样本加入离心管中。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液，并充分混合。
3. 在室温下孵育一段时间，以使细胞或组织充分裂解。
4. 用离心机将样本离心，以去除细胞碎片和其他固体物质。
2. miRNA结合接下来，我们将利用miRNA磁珠将miRNA结合并分离出来。
具体步骤如下： 1. 向离心管中加入适量的miRNA磁珠，并充分混合。
2. 在室温下孵育一段时间，以使miRNA与磁珠结合。
3. 使用磁珠分离架将磁珠沉积到离心管底部，然后将上清液小心地倒掉。
4. 用洗涤缓冲液洗涤磁珠，以去除非特异性结合的物质。
5. 重复洗涤步骤，直到上清液清澈为止。
3. miRNA洗脱最后，我们需要将miRNA从磁珠上洗脱下来，以得到纯净的miRNA样品。
具体步骤如下： 1. 加入适量的洗脱缓冲液，并充分混合。
2. 在室温下孵育一段时间，以使miRNA从磁珠上洗脱下来。
3. 使用磁珠分离架将磁珠沉积到离心管底部，然后将上清液转移到一个新的离心管中。
4. 检查洗脱液的浓度和纯度，以确保miRNA 样品的质量。
注意事项在进行microrna磁珠手动提取时，我们需要注意以下几点： 1. 严格按照试剂盒的说明书操作，避免交叉污染和误操作。
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◆RNAmisi microRNA快速提取试剂盒◆目录号1105◆使用手册◆实验室使用，仅用于体外RNAmisi microRNA快速提取试剂盒目录号：1105目录编号包装单位110501 50次适用范围：适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA 试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次Lysis/Binding buffer 4°C避光50 ml70%乙醇室温9ml RNase-free H2O第一次使用前按说明加指定量乙醇Wash Solution 1 室温12 ml第一次使用前加入28ml无水乙醇Wash Solution 2/3 室温10 ml第一次使用前加入42ml无水乙醇RNase-free H2O 室温10 ml吸附柱RA和收集管室温50套microRNA吸附柱MA和收集管室温50套本试剂盒按照指示储存6个月不影响使用效果。
储存事项1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存一个月，如果要更长时间保存，请存放在4°C，但是使用前，应该先回复到室温。
2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
3.运输在常温下进行，不影响使用效果。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。
但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。
本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。
3.快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4.多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留,可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。
注意事项1.第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!2.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。
4.Lysis/Binding buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.预防RNase 污染，应注意以下几方面：1)经常更换新手套。
因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。
但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 MNaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4)配制溶液应使用无RNase 的水。
（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。
）6.RNA 纯度及浓度检测：完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。
由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。
动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S 和18S rRNA。
动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。
出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。
高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。
OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。
同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260, OD280 测定，按照以下公式进行RNA 浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
操作步骤：（提取包含microRNA的总RNA）提示：⇨第一次使用前请先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇！1.组织培养细胞a.收集<107悬浮细胞到一个1.5ml离心管。
（对于贴壁细胞，孔板培养和细胞瓶培养可以直接裂解，尽可能吸干净所有培养液残留后直接加入1ml的Lysis/Binding buffer, 迅速轻摇使Lysis/Binding buffer充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶，轻轻用移液枪反复吹打混匀接操作步骤项下3。
）b.13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。
完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入1ml Lysis/Binding buffer，涡旋或者吹打，充分裂解混匀。
d.接操作步骤项下3。
2.动物组织（例如鼠肝脑）a.新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,根据处理组织的质量，按照50-100mg加入1ml的比例加入Lysis/Binding buffer后电动或者手动彻底匀浆。
或者在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉（约50-100mg）转入装有1ml Lysis/Binding buffer 的1.5ml离心管中,剧烈吹打涡旋混匀。
b.可选,一般不需要：如果处理量大,有明显颗粒或者不溶物,非常粘稠或者裂解不充分, 可立即用带针头的一次性5 ml(约0.9mm针头) 注射器抽打裂解物10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
c.接操作步骤项下3。
3.室温放置5分钟以充分分离核酸蛋白复合物。
4.加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒。
5.室温放置2-3分钟，13，000rpm离心10分钟。
6.小心取上清（约600μl）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的，通常900μl），涡旋混匀。
此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。
7.将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。
8.加700μl 700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。
9.加入500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
加入500μl Wash Solution 2/3,重复一遍。
10.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在100℃水浴中预热效果更好），室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。
12.如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤11, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1 5–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。
附：microRNA富集方法（仅仅提取microRNA，不包含>200 nt其它总RNA成份。
）1.按照前面标准操作步骤1－5操作，直到得到上清。
2.较精确估计上清体积（约600μl），加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
3.将混合物加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30-60秒，收集滤过物。
将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。
合并两次滤过物，计算体积。
此时，滤过物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤8－11操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。
4.较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
5.取一套新的microRNA吸附柱MA，将上一步骤混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。
6.按照前面标准操作步骤8－11操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。
注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。
富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。