大肠杆菌感受态细胞
大肠杆菌感受态细胞的转化方法
一、概述大肠杆菌是一种常见的微生物细菌，广泛存在于自然界中。
而大肠杆菌感受态细胞的转化方法，是一项重要的研究课题。
本文旨在探讨大肠杆菌感受态细胞的转化方法，以期为相关领域的学者和研究人员提供参考。
二、大肠杆菌感受态细胞的定义大肠杆菌感受态细胞是指能够接受外源DNA并进行转化的大肠杆菌细胞。
在细菌转化的过程中，外源DNA能够通过不同的方式导入大肠杆菌感受态细胞内，并且在某种条件下，使其获得新的遗传信息，从而表现出与原有菌株不同的性状。
三、大肠杆菌感受态细胞的转化方法1. 热激转化方法热激转化方法是将需要转化的大肠杆菌细胞与外源DNA在高温条件下共培养，利用高温使大肠杆菌细胞的细胞壁变得松弛，使外源DNA能够顺利进入细胞内。
然后在低温下将其复性，并引起DNA与细胞的内合作用，最终实现外源DNA的转化。
2. 电穿孔法电穿孔法是通过将大肠杆菌感受态细胞暴露在高电场中，在电场作用力下使细胞膜发生孔道破裂，从而使外源DNA顺利进入细胞内，实现转化。
3. 化学法化学法是使用化学物质（如钙离子、聚乙二醇等）处理大肠杆菌感受态细胞，使细胞膜通透性提高，从而使外源DNA得以顺利进入细胞内，实现转化。
4. 冷冻法冷冻法是将需要转化的大肠杆菌感受态细胞与外源DNA共同置于冰冻条件下进行培养，利用冰冻条件下细胞膜通透性增加，使外源DNA能够进入细胞内，最终实现转化。
5. 基因枪法基因枪法是利用基因枪将外源DNA通过高速微粒轰击的方式，直接送入大肠杆菌感受态细胞内，从而实现转化。
6. 瞬时脉冲法瞬时脉冲法是利用高压脉冲将外源DNA导入大肠杆菌感受态细胞内，通过瞬时压力使细胞膜通透性增加，从而使外源DNA能够进入细胞内，实现转化。
四、大肠杆菌感受态细胞的转化效率影响因素1. 外源DNA的浓度外源DNA的浓度对大肠杆菌感受态细胞的转化效率有重要影响。
过高或者过低的外源DNA浓度都会降低转化效率。
2. 细胞状态大肠杆菌感受态细胞的生长状态和健康程度对转化效率有直接影响。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌感受态细胞制备和转化
DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于
细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收
DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温
一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如
卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培养物
涂在含卡那霉素的选择性培养基上，倒置培养过夜，
即可获得细菌菌落。
④ 涂平板: 将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含
Kana的筛选平板上，在菌液完全被培养基
吸收后，37℃倒置培养皿培养12~18h。 2
20008
分 子实
1
生验
0
物
学
注意：
1、含卡那霉素的LB固体培养基的配制:将灭菌的 LB固体培养基水浴溶解后冷却至60℃左右,加入 Kana储存液,使终浓度为50-100ug/ml,摇匀后到 平板；
细胞膜的通透性发生暂时性改变, 成为能允许外源 DNA
分子进入的细胞, 称感受态细胞。
2
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1
0
分 子实 生验
物 学
转化
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入 受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域 的基本实验技术。
2
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实验九，十
大肠杆菌感受态细胞的 制备和转化
一.实验原理
1.概念 感受态细胞
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移
到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种
转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另
一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,
需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后,
3-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四：大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E·coli K——12X1776菌株的转化结果，认为：（1）大肠杆菌受体菌培养时间为OD550=0.2—0.3（5—6107细胞/毫升）最好；（2）菌体用预冷的CaCl2洗涤二次，效果较好；（3）100mmol/LCaCl2处理可获得最高转化率；（4）菌体在pH 为6.0 的溶液悬浮时最为适宜。
大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）实验目的1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
2.了解大肠杆菌感受态细胞的生理特性和制备原理。
实验原理受体或宿主细胞容易接受外源DNA的状态称为感受态，通过物理或化学的方法，人工诱导细胞成为敏感的感受态细胞，以便外源DNA 进入，从而实现外源DNA在宿主细胞内大量复制和表达。
在低温、低浓度CaCl2的作用下，大肠杆菌细胞膜的磷脂双分子层形成液晶结构，细胞外膜和细胞内膜间隙中的部分核酸酶解离，细胞膜的通透性增加，此时大肠杆菌成为感受态细胞。
实验器材高温高压灭菌锅、超净工作台、牙签、移液器、移液器吸头、离心管、离心管架、EP管、恒温摇床、恒温培养箱、三角瓶、培养皿、离心机、制冰机等。
实验试剂（1）培养基：LB，LA。
（2）溶液：10%甘油+0.1mol/L CaCl2溶液，0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液。
（3）菌株：E.coli DH5α。
实验操作（1）用灭菌的牙签蘸取少量E.coli DH5α菌液划线接种于LA 培养基上，放在恒温培养箱37℃培养后，挑取单菌落接种于10ml LB 培养基中，于37℃摇床、200rpm过夜培养。
（2）按1∶100的接种比例将过夜培养的菌液转接至100～200ml 的LB培养基中，于37℃摇床、200rpm培养3～4h，使菌液的OD600达到0.6～0.8。
（3）冰浴菌液30min，同时将灭菌过的离心管、移液器吸头、“10%甘油+0.1mol/L CaCl2”溶液等放进冰箱预冷，在超净工作台中将菌液分装到预冷的50ml的离心管中，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（4）离心后尽量除去培养液，用预冷的“0.08mol/LMgCl2+0.02mol/L CaCl2溶液”重悬菌体，冰浴25min后，于4℃离心机中4000rpm离心15min。
（5）离心后弃去上清液，重复步骤（4）一次。
（6）弃去上清液后，将菌体重悬于冰冷的“10%甘油+0.1mol/LCaCl2溶液”中，按每管80μl分装至预冷的灭菌的EP管中，-80℃保存备用。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物技术领域。
在生物技术中，大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。
感受态细胞是指细胞表面有特定的受体，能够感受到外界的信号，从而引发细胞内的反应。
下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
1. 菌株的选择首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。
常用的菌株有DH5α、BL21等。
这些菌株具有较高的转化效率和稳定性，适合用于感受态细胞的制备。
2. 受体的构建感受态细胞的制备需要构建受体。
受体是一种蛋白质，能够与外界的信号分子结合，从而引发细胞内的反应。
常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。
构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。
3. 质粒的构建构建受体需要使用质粒。
质粒是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制。
常用的质粒有pET、pGEX等。
构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。
4. 细胞的转化将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。
转化是指将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白。
转化需要进行化学转化、电转化等步骤。
5. 细胞的培养转化后的细胞需要进行培养。
培养条件包括温度、氧气、营养物质等。
培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。
6. 受体的表达和纯化经过培养后，细胞内的受体会被表达出来。
为了得到纯净的受体，需要进行蛋白质纯化。
常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。
7. 受体的功能验证得到纯净的受体后，需要进行功能验证。
功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合，并引发细胞内的反应。
常用的功能验证方法有荧光共振能量转移（FRET）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。
大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行菌株的选择、受体的构建、质粒的构建、细胞的转化、细胞的培养、受体的表达和纯化、受体的功能验证等步骤。
这些步骤需要严格控制，才能得到高质量的感受态细胞。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主(受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态:即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15％的无菌甘油或—70℃保存有效期6个月。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后,使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项一、引言大肠杆菌感受态细胞是一种重要的实验材料，用于研究细胞信号转导等生物学问题。
制备感受态细胞需要注意许多事项，本文将从实验前的准备、菌种的选取、培养条件的控制、质量检测等方面进行详细阐述。
二、实验前的准备1. 实验室环境要保持干净卫生，避免灰尘和异味对实验产生影响。
2. 实验器具和试剂要提前清洗消毒，确保无菌状态。
3. 实验人员要做好个人卫生，穿上实验服和手套，并进行必要的消毒处理。
三、菌种的选取1. 选择适合自己实验目的和条件的大肠杆菌品种。
2. 选择优质的菌株，如DH5α或BL21(DE3)等常用品种。
3. 菌株应该保存在低温下，并定期检测其纯度和活性。
四、培养条件的控制1. 培养基应该选择适合大肠杆菌生长和表达蛋白质所需营养物质组成的培养基。
2. 培养温度、pH值、氧气含量等条件应该根据不同的菌株和实验目的进行调整。
3. 需要注意的是，大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行诱导，诱导剂类型、浓度和时间等参数也需要进行优化。
五、质量检测1. 感受态细胞的制备应该进行一系列质量检测，包括蛋白质表达水平、纯度和活性等方面。
2. 蛋白质表达水平可以通过Western blot或SDS-PAGE等方法进行检测。
3. 纯度可以通过蛋白质纯化和质谱分析等方法进行检测。
4. 活性可以通过生物活性实验或酶活性分析等方法进行检测。
六、其他注意事项1. 实验过程中要保持细心、耐心和严谨，避免操作失误影响实验结果。
2. 实验数据应该记录详细并及时处理，避免数据丢失或混乱。
3. 实验结果应该经过统计分析并与文献资料进行比较，确保结果可靠和准确。
七、结论大肠杆菌感受态细胞的制备是一个复杂而重要的实验过程，需要注意许多事项。
只有在实验前的充分准备、菌株的选择、培养条件的控制、质量检测等方面做好工作，才能获得高质量的感受态细胞，并为后续研究提供可靠的实验材料。
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。
实验九大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
02
在实验过程中，发现感受态细胞的质量和转化效率受到多种因素的影响，如试 剂浓度、温度、时间等。因此，需要严格控制实验条件，确保实验结果的可靠 性和可重复性。
03
实验中还发现，不同批次的大肠杆菌菌株对感受态细胞制备和转化的影响也较 大，这可能与菌株的遗传背景和生理状态有关。因此，在实验中应尽量使用同 一种菌株，以保证结果的稳定性。
序列分析
对转化子进行序列分析，进一步验证目的基 因的准确性。
05
结果与数据分析
转化效率的计算
转化效率计算公式
转化效率 = (转化子数量 / 菌落总数) × 转化体系中 DNA的总量。
转化效率的影响因素
感受态细胞的制备方法、DNA的质量和浓度、转化条 件等。
转化效率的优化
通过调整感受态细胞制备方法和优化转化条件，可以 提高转化效率。
实验材料与试剂
实验材料：大肠杆菌菌株
大肠杆菌菌株
用于制备感受态细胞和转化实验的基本材料，应选择生长旺 盛、纯度高的菌株。
注意事项
确保菌株无污染，并按照实验室规定进行菌株保存和使用。
试剂：CaCl2、LB培养基、Amp等
CaCl2
用于制备感受态细胞的试剂，能够提高大肠 杆菌的转化效率。
LB培养基
用于培养大肠杆菌的生长，提供必要的营养 物质。
02
实验过程中，通过调整试剂浓度、温度和时间等参数，优化了感受态 细胞的制备和转化条件。
03
成功将外源DNA导入感受态细胞，并通过抗生素筛选获得了转化子。
04
实验结果表明，感受态细胞的制备和转化是实现基因克隆和表达的关 键步骤，为后续的分子生物学实验奠定了基础。
结果分析与讨论
01
实验结果与预期基本一致，成功实现了大肠杆菌感受态细胞的制备和转化。
第一章 1-4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.
1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。
☺感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。
☺转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。
适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。
制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。
但保存时间过长会使转化效率受到影响。
新鲜细胞4 ℃保存可用5天。
用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。
(具体操作及参数,参考仪器说明3☺下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态–玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养约3小时。
为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。
2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。
3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。
4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
2
3
4
实验步骤
注意事项 思考题
5
6
实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
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转化（transformation）：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细 胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程 等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现 遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。
预冷CaCl2溶液（பைடு நூலகம்.1mol／L） .
4．操作步骤
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取 一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中， 37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将 该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体 培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开 始 出 现 混 浊 后 ， 每 隔 20 ～ 30min 测 一 次 OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
.
2）细胞转化
(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操 作)，第一组，加入10 µl重组质粒DNA(体 积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞，此管为 转化实验组。第二组，插入DNA片段对照 组，即酶切后DNA片段25ng+100µl感受态 细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即 1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100µl感 受态细胞悬液。
列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补 肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖 苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载 体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列的 宿主细胞中时，在异丙基--D硫代半乳糖苷 （IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种 肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们 可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所
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将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则， 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的 质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖， 但对于连接混合物而言，此时并不能确定 哪个克隆含有插入片段。
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重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、 插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最 常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶 切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以 结合-互补现象来筛选。
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-互补现象：
因为有些载体都带有一个LacZ基因的调控序
大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选
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1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术以及筛选转化体的技 术。了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义。
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2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl， RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA 的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞 (competent cell) 。
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（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管 中 ， 在 冰 上 冷 却 20-30min ， 于 4℃ ， 4000r ／min离心10min（从这一步开始，所有操 作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（ 3 ） 倒 净 上 清 培 养 液 ， 用 1ml 冰 冷 的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； （4）0～4℃，4000r／min离心10min； （ 5 ） 弃 去 上 清 液 ， 加 入 500µl 冰 冷 的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 0～4℃，4000r／min离心10min；
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转化的方法：
1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处 理将载体DNA分子导入受体细胞；
2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。
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克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等；
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（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／ L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻 后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌 过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置 于-70℃条件下，可保存半年至一年。
以称这种现象为-互补现象。
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由互补产生的－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用
于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利 用这个特点，在载体的该基因编码序列之间 人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源
DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破
坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。 所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重 组质粒的菌落为蓝色。
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(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置2030min ， 于 42℃ 水 浴 中 保 温 1 － 2min ， 然 后 迅速冰上冷却2min
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重组DNA转化细菌过 程示意图
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3．仪器、材料和试剂
无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心 机，移液器，微型离心管等；
菌株：E.coli DH5α
质粒：pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以 及pBluscript KS 空质粒；
LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉 素 ， 浓 度 50-100µg ／ mL ， X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG 配 制 成 1000 储 备 液 ， 用 时 按 培 养 基 的 量 再 加 入）；