发酵工程中的菌种
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第四章 微生物优良菌种的选育
微生物发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
提纲
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
原理 基本方法 放线菌 霉菌 酵母菌
杂交育种
细菌
原生质体融合 基因工程技术
基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性
放线菌的杂交方法
混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。 平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。 玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培 养，未长气生菌丝时，纸移至一选 择平板，获异核系。解剖镜下，小 针收集小菌丝，于完全平板涂布， 获分离子。
３、霉菌的杂交育种
准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程． 异核体的形成：两不Fra Baidu bibliotek性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面——扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。
影响诱变的因素：
出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮） ； 诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：70-80％）。 诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。
筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。
初筛→复筛→确定最佳发酵条件（负变多，正变少）
①加诱导酶合成抑制物
②交替培养法 ③显色反应法
筛选方法
①加诱导酶合成抑制物
如：加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖， 生长，被富集。
②交替培养法
含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导 物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。
２、放线菌的杂交育种
基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．
放线菌的遗传体系和杂交原理：
异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。 接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区） 重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。
优良菌种应具备的特征
选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强， 抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）
一、自然选育
③显色反应法
不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变 化）——检出。
４.抗（敏感）性突变株筛选
包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 ①抗生素抗性突变：提高产量； ②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；
（与噬菌体存在与否无关）
③条件抗性突变：如温度，可提高产量；
（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）
④物敏突变：
通过杂交得二倍体来育种。
方法：获单倍体细胞；杂交。
杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞； 单倍体细胞间。
四、原生质体融合育种
借助原生质融合技术实现遗传物质的交换 １.原生质体融合的优越性：
受限制小； 重组频率高； 可先用理化因子处理； 遗传物质传递更充分； 其诱变率更高。
２.原生质体融合法：
原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出
利用微生物自然突变进行的菌种选育。 原因：多因素低剂量的诱变效应； 互变异构效应 结果：负变大于正变，应经常分离纯化 方法：菌悬液→平板分离→上摇瓶→检测→ 选种→保藏
优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低，10-8—10-9 /次分裂。
二、诱变选育
诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包 括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。
如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。
三、杂交育种
长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种
方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接 合。获部分合子。 出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、 温敏、发酵性能
方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者 死，突变为抗者，生并产菌落） 营养缺陷型回复突变株筛选。 （活性复，结构改变）
３、组成型突变株筛选
诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。
突变发生在调节基因或操纵基因,解除对 诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法：设计条件使组成型优势生长， 或通过菌落分辨。
１、营养缺陷型突变株筛选
酶缺陷，结果造成中间产物积累；
解除协同反馈，使另一分支末端产物积累； 渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末 端产物少，中间产物积累。
２、抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变株筛选
调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏 蛋白与终产物不能结合或结合； 结合，但不发生作用； 结构基因突变，使结构酶无结合能力但 有催化活性；
霉菌的杂交技术
诱变获具标记的亲本。 异核体的形成：基本培养基上，强迫进行 营养互补。还可用多种方法。 双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。 分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分 离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢 子至斜面，再纯化鉴别。
４、酵母菌的杂交育种
双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史
二倍体生活力强，生产能力高，可
优良菌种应具备的特征
对菌种的要求
天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。
1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产
物的产量高，其它代谢产物少
2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素
微生物发酵的一般流程
培养基配制 种子扩大培养 空气除菌 发酵设备
培养基灭菌
发酵生产
下游处理
提纲
微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育
原理 基本方法 放线菌 霉菌 酵母菌
杂交育种
细菌
原生质体融合 基因工程技术
基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性
放线菌的杂交方法
混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢 子悬液，选择性平板分离。 平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上，获 孢子后再影印至选择平板上。 玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培 养，未长气生菌丝时，纸移至一选 择平板，获异核系。解剖镜下，小 针收集小菌丝，于完全平板涂布， 获分离子。
３、霉菌的杂交育种
准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程． 异核体的形成：两不Fra Baidu bibliotek性状细胞（菌丝）连接，导致一 细胞存在两个不同遗传型核。 杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成 杂合核，为双倍体。 菌丝成斑点、扇面——扇变。 体细胞重组：杂合二倍体只具有相对稳定性，繁殖过程 发生染色体交换，单倍化，形成各种分 离子。 准性生殖的单倍体化是一个渐变过程，需要多次分 裂，形成双倍体、非整倍体、单倍体等分离子。
影响诱变的因素：
出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮） ； 诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过 低，致死率：70-80％）。 诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。
筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。
初筛→复筛→确定最佳发酵条件（负变多，正变少）
①加诱导酶合成抑制物
②交替培养法 ③显色反应法
筛选方法
①加诱导酶合成抑制物
如：加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖， 生长，被富集。
②交替培养法
含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导 物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。
２、放线菌的杂交育种
基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．
放线菌的遗传体系和杂交原理：
异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无 重组体出现。 接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分 合子。整+部分、部分+部分。 异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 （单交换，二体区） 重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重 组子，产生重组子孢子。
优良菌种应具备的特征
选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强， 抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）
一、自然选育
③显色反应法
不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变 化）——检出。
４.抗（敏感）性突变株筛选
包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 ①抗生素抗性突变：提高产量； ②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；
（与噬菌体存在与否无关）
③条件抗性突变：如温度，可提高产量；
（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）
④物敏突变：
通过杂交得二倍体来育种。
方法：获单倍体细胞；杂交。
杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞； 单倍体细胞间。
四、原生质体融合育种
借助原生质融合技术实现遗传物质的交换 １.原生质体融合的优越性：
受限制小； 重组频率高； 可先用理化因子处理； 遗传物质传递更充分； 其诱变率更高。
２.原生质体融合法：
原生质体制备 原生质体融合和再生 融合子的检出
利用微生物自然突变进行的菌种选育。 原因：多因素低剂量的诱变效应； 互变异构效应 结果：负变大于正变，应经常分离纯化 方法：菌悬液→平板分离→上摇瓶→检测→ 选种→保藏
优点：简单易行，可与生产同步进行。 缺点：频率低，10-8—10-9 /次分裂。
二、诱变选育
诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包 括诱变和筛选两个步骤。 原理：染色体畸变；基因突变。
如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸敏感突变型， 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。
三、杂交育种
长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质 得以交换（获优良性状集中的重组体）。 1.细菌的杂交育种
方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接 合。获部分合子。 出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、 温敏、发酵性能
方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者 死，突变为抗者，生并产菌落） 营养缺陷型回复突变株筛选。 （活性复，结构改变）
３、组成型突变株筛选
诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。
突变发生在调节基因或操纵基因,解除对 诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法：设计条件使组成型优势生长， 或通过菌落分辨。
１、营养缺陷型突变株筛选
酶缺陷，结果造成中间产物积累；
解除协同反馈，使另一分支末端产物积累； 渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末 端产物少，中间产物积累。
２、抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变株筛选
调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏 蛋白与终产物不能结合或结合； 结合，但不发生作用； 结构基因突变，使结构酶无结合能力但 有催化活性；
霉菌的杂交技术
诱变获具标记的亲本。 异核体的形成：基本培养基上，强迫进行 营养互补。还可用多种方法。 双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。 分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分 离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢 子至斜面，再纯化鉴别。
４、酵母菌的杂交育种
双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史
二倍体生活力强，生产能力高，可
优良菌种应具备的特征
对菌种的要求
天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。
1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产
物的产量高，其它代谢产物少
2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退化 4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素