血友病的基因诊断

I-1
APTT PT TT
s
s
s
Fg vWF FVIII ：C
g/L %
%
28.9 11.3 17.7 3.3
141
121
？ ？
I-2
27.2 10 18.6 2.4
124
118
II-1
75.2 12.1 17.7 2.1
121
2. 1
II-2
39 11.5 18.8 2.8
142
107
30
II-3
均为阴性
23
间接诊断结果
BclI酶切图 III-1表姐： -/II-2舅妈： -/II-3母亲： +/II-4父亲： +/+ III-2待检者：+/+
M 24
BclI酶切图测序图
BclI酶切识别位点
T/GATCA
a
图a 待检者测序图， 含BclI酶切位点
图b 表姐测序图，不
含BclI酶切位点
b
25
20
FVIII:C 2%
21
直接基因测序
• 结果：
直接测序未检测出突变。
• 原因：
据文献报道FVIII直接基因测序有1%-10% 的患者查不到基因突变
（ Hum Mutat. 2002 Oct;20(4):26774）
突变可能在内含子中
可能存在大的缺失
22
携带者诊断结果
携带者及待检者
F8内含子22倒位
340 340
172 172
374 374
2
319 325 218 220 150 150 282 280 340 340 172 172 374 374
HA患者
胎儿
3 323 212 150 282 346 172 365
13
第二代标志
• 6个与F8 紧密连锁的STR位点： DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和
DXS1108 距F8 1.5Mb内 1个F8 内的STR位点(F8Civs13) • 性别位点为牙釉蛋白基因（Amelogenin gene） 终产物 X染色体102bp，Y染色体 108bp
40.1 12.5 20.65 1.9
164
119
基因检测结果
F8内含子22倒位 F8内含子1倒位
先证者 阳性（携带者） 阴性
胎儿 阴性
阴性
其他人 阴性
阴性
• 先证者F8基因所有外显子及其侧翼序列扩增测序 （-）
31
遗传连锁分析
319
323 325
218
212 220
I
150
150 150
282
27
血友病A携带者间接诊断结果分析
舅舅 表姐
舅妈
父亲
综合A13、CA22及 Bcl I 信息，待检者与 其表姐有不同的X染 色体。
母亲 待检者 28
女性血友病A的基因及产前诊断
标本来源
先证者（II-1），女，21岁，汉族，自幼有踝关 节及膝关节有自发出血，临床诊断为血友病A， 冷沉淀及浓缩FVIII输注有效，因怀孕要求作基因 诊断及产前诊断
14
第三代位点的开发
• 对象：69名正常女性、31个血友病A家 系（120名相关成员）
• 方法：在人类基因组数据库中选择了位 于F8基因两端0.5CM内的三个STR位点 （5_226、5_147及3_486），F8基因内 的1个STR位点（INTRON25）及距离F8 基因2CM内的DXS8069位点，以多重荧 光PCR法检测5个微卫星位点的多态性
1
2 282 280
340
346 340
172
172 172
374
365 374
II 1
4
319 325
325
218 220
212
150 150
130
282 280
280
III
340 340
172 172
1 340 172
374 374 325 325 374
220 212
150 130
280 280
3
内含子22倒位
4
结果（1）
内含子22 倒位检测结果 5
内含子1倒位机制
6
内含子1倒位检测方法
2Kb 1.5Kb
2Kb 1.5Kb
7
血友病携带者和产前诊断流程
外周血DNA抽提（携带者） 羊水DNA抽提（胎儿）
PCR扩增
长链PCR检测内含子1,22倒位
①
直接核酸测析
间接联锁分析
③
②
明确诊断
血友病A
血友病的基因诊断
1
背景
血友病A 10～20/10万，绝对患病数约13～26万（中国） 无完整的诊断体系，误诊、漏诊、病死率高 替代治疗：传播疾病，经济负担重
感染HCV， HBV，HIV，$14万/年/人（美国 ) 致死（残）率极高 遗传后代
2
p
血友病A、B
q
X染色体来自百度文库
FIX (Xq27) FVIII (Xq28)
杂合度 72.46% 49.27% 72.46% 49.27% 31.88%
多态性 单独可诊断率
12
80.65%
6
54.84%
6
64.52%
6
58.06%
3
41.94%
联合5个STR位点可对所有要求做携带者及产前诊断 的血友病A家系提供遗传连锁分析结果且与F8基因直接 检测结果相符
17
结果与讨论
DXS8069 DXS1073
①、 ② 、③
8
血友病A
间接基因诊断
• 第一代标志
F8基因内的BclⅠRFLP F8基因内两个STR位点 F8基因外的St14 VNTR
10
家系15 Bcl I RFLP位点多态性连锁分析
11
家系13 st14位点VNTR多态的基因连锁分 析
12
内含子13中STR多态位点用于家系12基因连锁分 析
7重荧光PCR技术
3-486
降低重组发生率
F8
Intron25
F8Civs13 未见漏诊和误诊
5-147
5-226
诊断率和准确率100％
18
特殊血友病A家系的基因诊断
• 先证者自幼皮肤、头颅撞伤后及拔牙及手术后有 出血难止，曾发生过颅内出血
• BT、PT正常 • APTT延长，FVIII:C 2% • 输注全血或抗血友病球蛋白治疗有效 • 先证者已故
间接诊断结果
ca13 基因扫描
III-1 表姐：144/144 III-2待检者： 142/142 II-3母亲：142/144 II-2舅妈：140/144
26
II-4父亲：142/-
间接诊断结果
ca22基因扫描
III-1 表姐：79/79 III-2待检者：79/83 II-3母亲：83/79 II-2舅妈：79/79 II-4父亲：79/-
15
ST14 DXS15 DXS9901
G6PD
DXS1073 F8
F8
CA22
F8Civs13
DXS1108
DXS8069 DXS1073
3-486 Intron25 F8Civs13
5-147 5-226
16
结果与讨论
Marker 5_226 5_147 DXS8069 3_486 INTRON25