口服胰岛素羧甲基壳聚糖纳米粒的制备及评价
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中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10
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口服胰岛素羧甲基壳聚糖纳米粒的制备及评价
李心愿，熊富良，徐仕奇，刘霞，张雪琼 （武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070）
［摘要］ 目的： 研制一种生物利用度高且具有缓释作用的口服胰岛素制剂。方法： 通过钙离子交联制备羧甲基壳聚糖纳米 粒，采用正交试验优化纳米粒制备条件，以透射电镜观察纳米粒形态，激光粒度分析仪测定粒度，高效液相色谱法测定纳米粒 包封率和载药量，并对胰岛素的体外释放性能进行考察。结果： 优化工艺制备的纳米粒外观形态圆整，平均粒径为( 256． 1 ± 11． 2) nm，包封率为( 45 ± 0． 41) % ，载药量为( 17． 2 ± 0． 33) % ，药理相对生物利用度为14． 71% 。结论： 口服载胰岛素羧甲基壳 聚糖纳米粒具有降血糖作用和显著的缓释作用，药理相对生物利用度高。 ［关键词］ 羧甲基壳聚糖; 纳米粒; 胰岛素; 口服; 降血糖作用
LI Xin-yuan，XIONG Fu-liang，XU Shi-qi，LIU Xia，ZHANG Xue-qiong （ Wuhan University of Technology，School of
Chemistry，Chemical Engineering and Life Sciences，Hubei Wuhan 430070，China）
健康雄性昆明种小鼠（ KM 小鼠） 若干只，体质 量（20． 0 ± 5． 0） g，动物许可证号：SCXK（ 鄂） 20080005，均由湖北省实验动物研究中心提供。 2 方法与结果 2． 1 方法 2． 1． 1 纳米粒的制备 室温下将羧甲基壳聚糖 20 mg 溶于 10 ml 去离子水中，在磁力搅拌器上搅拌至 完全溶解，制成 2 mg·ml － 1 的溶液，加入一定量的猪 胰岛素，用盐酸调节 pH 值使胰岛素完全溶解。然 后在搅拌条件下，加入一定浓度的氯化钙水溶液至 出现乳光。 2． 1． 2 制备工艺的筛选 在单因素考察的基础 上，选择胰岛素和羧甲基壳聚糖质量之比 （ A） ，pH 值（ B） ，氯化钙浓度（ C）3 个因素进行考察，每个因 素选择 3 个水平，见表 1。以正交设计表 L9 （34 ） 进 行实验，以纳米粒的包封率为指标进行纳米粒的制 备工艺筛选。 2． 1． 3 筛选后制备工艺的重复性考察 按正交试 验结果得出的最佳制备工艺条件，重复制备 3 批纳 米粒样品，并通过对各批号纳米粒包封率的测定，考 察纳米粒制备工艺的重复性。 2． 1． 4 外观形态及粒径 取 1 ～ 2 滴纳米粒溶液 置于覆有支持膜的铜网上停留 2 ～ 3 min，自然干燥， 在透射电 镜 下 观 察 纳 米 粒 的 形 态［7］。 另 取 适 量 纳 米粒溶液加去离子水稀释到适当浓度，用激光粒度 分析仪测定粒径。 2． 1． 5 包封率和载药量测定 将纳米粒溶液低温 高速离心（4 ℃ ，12 000 r·min － 1 离心 30 min） ，再用 高效液相色谱法测定上清液中胰岛素的含量，按下 式计算纳米粒的包封率和载药量。包封率（ ER） = ［（ W1 － W2） / W1］× 100% ；载药量（ DL） = ［（ W1 － W2） / W］× 100% 。其中 W1 为投药量，W2 为上清 液中的药量，W 为纳米粒质量。色谱条件：Hisep C18 （4． 6 mm × 250 mm，5 μm） ；流动相：0． 2 mol·L － 1 硫 酸盐缓冲液（ 取无水硫酸钠28． 4 g，加水溶解后，加 磷酸2． 7 ml，水 800 ml，用乙醇胺调 pH 至2． 3，加水 至1 000 ml） -乙腈（74∶ 26） ；流速：1 ml·min － 1 ；柱温 40 ℃ ；波长：214 nm。 2． 1． 6 药物体外释放试验 准确量取 2 份胰岛素
ห้องสมุดไป่ตู้
我 国 现 有 糖 尿 患 者 超 过 4 000 万，居 世 界 第 二［1］。胰岛素是 1 型糖尿病治疗的必需药物，临床 应用疗效确切，作用迅速，属蛋白质类生物大分子， 目前皮下注射是主要的给药方式，每日需注射 3 ～ 4 次。长期频繁的皮下注射给患者带来痛苦，顺应性 较差，因而不能维持血糖量正常，严重影响糖尿病的 治疗和并发症的防治。同时，皮下注射还可能产生 皮下脂肪萎缩和低血糖等不良反应［2］。为此，国内 外药学工作者一直致力于胰岛素非注射途径的研 究，如鼻腔、直肠、口服、肺、眼、透皮吸收等。在上述 给药途径中，口服给药因其简便、直观、患者的顺应 性好、可接受程度高，而尤为引人关注。此外，由于 口服给药后肝门静脉内的胰岛素浓度较高，更接近 于生理状态下胰岛素的分泌和代谢模式。一直以 来，胰岛素口服给药是世界研究的热点和难点。其 难点主要在于［3］：（1） 消化道中的复杂酶体系可使 胰岛素迅速水解失活；（2） 胃肠壁上皮细胞层的致
［中图分类号］ R944 ［文献标识码］ A ［文章编号］1001-5213（2015）10-0887-04 DOI：10． 13286 / j． cnki． chinhosppharmacyj． 2015． 10． 06
Preparation and evaluation of oral insulin-loaded carboxymethyl chitosan nanoparticles
ABSTRACT：OBJECTIVE To prepare oral insulin-loaded nanoparticles with high bioavailability and sustained release． METHODS Carboxymethyl chitosan nanoparticles were prepared through ionic gelification with calcium ions． Orthogonal test design was used to optimize preparation process． Shapes of nanoparticles were studied by TEM． Nanoparticle size was evaluated by laser particle size determination． High performance liquid chromatography was used to detect drug-loading rate and entrapment efficiency of particles， and the in vitro release was investigated． RESULTS Novel nanoparticles were spherical，homogeneous in particle size （ 256． 1 ± 11． 2） nm，entrapment efficiency （45 ± 0． 41） % and drug-loading capacity （17． 2 ± 0． 33） % ． The relative pharmacological bioavailability of insulin-loaded nanoparticles reached 14． 71% ． CONCLUSION The insulin-loaded nanoparticles show steady and effective hypoglycemic effects after oral administration and the relative pharmacological bioavailability is high． KEY WORDS：carboxymethyl chitosan； nanoparticle； insulin； oral； hypoglycemic effect
密结构以及细胞内存在的代谢酶系统，大大降低了 胰岛素的跨膜转运。一般情况下，胰岛素口服给药 的生物利用度不到 1% 。
羧甲基壳聚糖是一种 天 然 的 多 糖 大 分 子［4-5］， 其具有良好的生物相容性，生物可降解性，生物粘附 性，并且无 生 物 毒 性，具 有 良 好 的 水 溶 性［6］。 其 价 格低廉，可作为一种良好的生物材料输送蛋白质类 药物［4］。本文 通 过 离 子 交 联 法 制 备 载 胰 岛 素 的 羧 甲基壳聚糖纳米粒，增加胰岛素在胃肠道的稳定性， 提高口服胰岛素的生物利用度。 1 材料
羧甲基壳聚糖纳米粒溶液 5 ml 置于透析袋内，扎紧 后分别置于 30 ml 磷酸盐缓冲液（ PBS） （ pH 7． 4） 以 及人工胃液（ pH 约为1． 5） （ 按中国药典 2010 年版 第二部附 录 XA 中 方 法 配 制） 中，保 持 恒 温 （ 37 ± 1） ℃ ，转速 60 r·min － 1 ，并开始计时，分别于 1，2， 4，6，8，10，14，24，36 h 取透析液 3 ml，同时补充 3 ml 新鲜 PBS（ pH 7． 4） 或者人工胃液，维持释放介质 体积不变，高效液相色谱法测定峰面积，计算各个时
KDC － 160HR 高速冷冻离心机（ 科大创新股份 有限公司中佳分公司） LC10Atvp 高效液相 色 谱 仪 （ 日本岛津） ；BS － 124S 赛多利斯电子天平（ 北京陆 希科技有限公司） ；79 － 1 磁力加热搅拌器（ 常州澳 华仪器 有 限 公 司） ，2000HSA 型 激 光 粒 度 分 析 仪， JEM － 1200EX 型透射电镜。
间点的样品含量并计算累积释放量绘制累积释放曲 线。 2． 1． 7 小鼠血糖含量测定 按葡萄糖氧化酶法测 定血糖含量［8-9］。 2． 1． 8 糖尿病动物模型的建立 取健康的雄性 KM 小鼠，给药前禁食 24 h，称重，按 40 mg·kg － 1 剂 量于其尾静脉注射 3% （ w / v） 的四氧嘧啶溶液，正常 饲养 72 h 后禁食 12 h，尾静脉取血0． 2 ml。待血液 凝固后，12 000 r·min － 1 离心 4 min。精密量取血清 20 μl，采用葡萄糖氧化酶法测其血糖含量，血糖值 高于16． 67 mmol·L － 1 的为糖尿病模型的小鼠［10］。 2． 1． 9 糖尿病小鼠降血糖研究 取糖尿病小鼠 24 只，称重，随机分成 4 组，每组 6 只，实验前禁食 12 h，可自由饮水，灌胃给药。分别给予 PBS 溶液，胰 岛素 PBS 溶液（50 IU·kg － 1 ） 、胰岛素纳米粒（50 IU· kg － 1 ） ，皮下注射胰岛素（5 IU·kg － 1 ） ，在 0，1，2，4， 6，9，12 h 尾 部 静 脉 取 血 0． 2 ml，待 血 液 凝 固 后， 12 000 r·min － 1 离心 4 min。精密量取血清 20 μl，采 用葡萄糖氧化酶法测定其血糖值。然后采用梯形法 计算血糖下降百分率-时间曲线上的面积 AAC，采用 药理相对生物利用度（ 相对皮下注射胰岛素溶液） 来评价胰岛素的药物相对生物利用度［11］：
［基金项目］ 国家 自 然 科 学 基 金 （ 编 号：50973088 ） ［作 者 简 介］ 李 心 愿，男，研 究 方 向： 药 物 新 剂 型 研 究，电 话：027-87859029，E-mail： 780812464@ qq． com ［通讯作者］ 张雪琼，女，研究方向：药物新剂型研究，电话：027-87859019，E-mail：365464583@ qq． com
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中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10
羧甲基壳聚糖（ CMC，相对分子质量17． 4 kDa， 脱乙酰度 85% ，青岛弘海生物技术有限公司） ；猪胰 岛素（27 U·mg － 1 ，相对分子质量为5 807，徐州万邦 金桥制药有限公司）；氯化钙（ 天津市恒兴化学试剂 制造有限公司）；葡萄糖试剂盒（ 上海士峰生物科技 有限公司） ；四氧嘧啶（ 美国 Sigma 公司） 。
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口服胰岛素羧甲基壳聚糖纳米粒的制备及评价
李心愿，熊富良，徐仕奇，刘霞，张雪琼 （武汉理工大学化学化工与生命科学学院，湖北 武汉 430070）
［摘要］ 目的： 研制一种生物利用度高且具有缓释作用的口服胰岛素制剂。方法： 通过钙离子交联制备羧甲基壳聚糖纳米 粒，采用正交试验优化纳米粒制备条件，以透射电镜观察纳米粒形态，激光粒度分析仪测定粒度，高效液相色谱法测定纳米粒 包封率和载药量，并对胰岛素的体外释放性能进行考察。结果： 优化工艺制备的纳米粒外观形态圆整，平均粒径为( 256． 1 ± 11． 2) nm，包封率为( 45 ± 0． 41) % ，载药量为( 17． 2 ± 0． 33) % ，药理相对生物利用度为14． 71% 。结论： 口服载胰岛素羧甲基壳 聚糖纳米粒具有降血糖作用和显著的缓释作用，药理相对生物利用度高。 ［关键词］ 羧甲基壳聚糖; 纳米粒; 胰岛素; 口服; 降血糖作用
LI Xin-yuan，XIONG Fu-liang，XU Shi-qi，LIU Xia，ZHANG Xue-qiong （ Wuhan University of Technology，School of
Chemistry，Chemical Engineering and Life Sciences，Hubei Wuhan 430070，China）
健康雄性昆明种小鼠（ KM 小鼠） 若干只，体质 量（20． 0 ± 5． 0） g，动物许可证号：SCXK（ 鄂） 20080005，均由湖北省实验动物研究中心提供。 2 方法与结果 2． 1 方法 2． 1． 1 纳米粒的制备 室温下将羧甲基壳聚糖 20 mg 溶于 10 ml 去离子水中，在磁力搅拌器上搅拌至 完全溶解，制成 2 mg·ml － 1 的溶液，加入一定量的猪 胰岛素，用盐酸调节 pH 值使胰岛素完全溶解。然 后在搅拌条件下，加入一定浓度的氯化钙水溶液至 出现乳光。 2． 1． 2 制备工艺的筛选 在单因素考察的基础 上，选择胰岛素和羧甲基壳聚糖质量之比 （ A） ，pH 值（ B） ，氯化钙浓度（ C）3 个因素进行考察，每个因 素选择 3 个水平，见表 1。以正交设计表 L9 （34 ） 进 行实验，以纳米粒的包封率为指标进行纳米粒的制 备工艺筛选。 2． 1． 3 筛选后制备工艺的重复性考察 按正交试 验结果得出的最佳制备工艺条件，重复制备 3 批纳 米粒样品，并通过对各批号纳米粒包封率的测定，考 察纳米粒制备工艺的重复性。 2． 1． 4 外观形态及粒径 取 1 ～ 2 滴纳米粒溶液 置于覆有支持膜的铜网上停留 2 ～ 3 min，自然干燥， 在透射电 镜 下 观 察 纳 米 粒 的 形 态［7］。 另 取 适 量 纳 米粒溶液加去离子水稀释到适当浓度，用激光粒度 分析仪测定粒径。 2． 1． 5 包封率和载药量测定 将纳米粒溶液低温 高速离心（4 ℃ ，12 000 r·min － 1 离心 30 min） ，再用 高效液相色谱法测定上清液中胰岛素的含量，按下 式计算纳米粒的包封率和载药量。包封率（ ER） = ［（ W1 － W2） / W1］× 100% ；载药量（ DL） = ［（ W1 － W2） / W］× 100% 。其中 W1 为投药量，W2 为上清 液中的药量，W 为纳米粒质量。色谱条件：Hisep C18 （4． 6 mm × 250 mm，5 μm） ；流动相：0． 2 mol·L － 1 硫 酸盐缓冲液（ 取无水硫酸钠28． 4 g，加水溶解后，加 磷酸2． 7 ml，水 800 ml，用乙醇胺调 pH 至2． 3，加水 至1 000 ml） -乙腈（74∶ 26） ；流速：1 ml·min － 1 ；柱温 40 ℃ ；波长：214 nm。 2． 1． 6 药物体外释放试验 准确量取 2 份胰岛素
ห้องสมุดไป่ตู้
我 国 现 有 糖 尿 患 者 超 过 4 000 万，居 世 界 第 二［1］。胰岛素是 1 型糖尿病治疗的必需药物，临床 应用疗效确切，作用迅速，属蛋白质类生物大分子， 目前皮下注射是主要的给药方式，每日需注射 3 ～ 4 次。长期频繁的皮下注射给患者带来痛苦，顺应性 较差，因而不能维持血糖量正常，严重影响糖尿病的 治疗和并发症的防治。同时，皮下注射还可能产生 皮下脂肪萎缩和低血糖等不良反应［2］。为此，国内 外药学工作者一直致力于胰岛素非注射途径的研 究，如鼻腔、直肠、口服、肺、眼、透皮吸收等。在上述 给药途径中，口服给药因其简便、直观、患者的顺应 性好、可接受程度高，而尤为引人关注。此外，由于 口服给药后肝门静脉内的胰岛素浓度较高，更接近 于生理状态下胰岛素的分泌和代谢模式。一直以 来，胰岛素口服给药是世界研究的热点和难点。其 难点主要在于［3］：（1） 消化道中的复杂酶体系可使 胰岛素迅速水解失活；（2） 胃肠壁上皮细胞层的致
［中图分类号］ R944 ［文献标识码］ A ［文章编号］1001-5213（2015）10-0887-04 DOI：10． 13286 / j． cnki． chinhosppharmacyj． 2015． 10． 06
Preparation and evaluation of oral insulin-loaded carboxymethyl chitosan nanoparticles
ABSTRACT：OBJECTIVE To prepare oral insulin-loaded nanoparticles with high bioavailability and sustained release． METHODS Carboxymethyl chitosan nanoparticles were prepared through ionic gelification with calcium ions． Orthogonal test design was used to optimize preparation process． Shapes of nanoparticles were studied by TEM． Nanoparticle size was evaluated by laser particle size determination． High performance liquid chromatography was used to detect drug-loading rate and entrapment efficiency of particles， and the in vitro release was investigated． RESULTS Novel nanoparticles were spherical，homogeneous in particle size （ 256． 1 ± 11． 2） nm，entrapment efficiency （45 ± 0． 41） % and drug-loading capacity （17． 2 ± 0． 33） % ． The relative pharmacological bioavailability of insulin-loaded nanoparticles reached 14． 71% ． CONCLUSION The insulin-loaded nanoparticles show steady and effective hypoglycemic effects after oral administration and the relative pharmacological bioavailability is high． KEY WORDS：carboxymethyl chitosan； nanoparticle； insulin； oral； hypoglycemic effect
密结构以及细胞内存在的代谢酶系统，大大降低了 胰岛素的跨膜转运。一般情况下，胰岛素口服给药 的生物利用度不到 1% 。
羧甲基壳聚糖是一种 天 然 的 多 糖 大 分 子［4-5］， 其具有良好的生物相容性，生物可降解性，生物粘附 性，并且无 生 物 毒 性，具 有 良 好 的 水 溶 性［6］。 其 价 格低廉，可作为一种良好的生物材料输送蛋白质类 药物［4］。本文 通 过 离 子 交 联 法 制 备 载 胰 岛 素 的 羧 甲基壳聚糖纳米粒，增加胰岛素在胃肠道的稳定性， 提高口服胰岛素的生物利用度。 1 材料
羧甲基壳聚糖纳米粒溶液 5 ml 置于透析袋内，扎紧 后分别置于 30 ml 磷酸盐缓冲液（ PBS） （ pH 7． 4） 以 及人工胃液（ pH 约为1． 5） （ 按中国药典 2010 年版 第二部附 录 XA 中 方 法 配 制） 中，保 持 恒 温 （ 37 ± 1） ℃ ，转速 60 r·min － 1 ，并开始计时，分别于 1，2， 4，6，8，10，14，24，36 h 取透析液 3 ml，同时补充 3 ml 新鲜 PBS（ pH 7． 4） 或者人工胃液，维持释放介质 体积不变，高效液相色谱法测定峰面积，计算各个时
KDC － 160HR 高速冷冻离心机（ 科大创新股份 有限公司中佳分公司） LC10Atvp 高效液相 色 谱 仪 （ 日本岛津） ；BS － 124S 赛多利斯电子天平（ 北京陆 希科技有限公司） ；79 － 1 磁力加热搅拌器（ 常州澳 华仪器 有 限 公 司） ，2000HSA 型 激 光 粒 度 分 析 仪， JEM － 1200EX 型透射电镜。
间点的样品含量并计算累积释放量绘制累积释放曲 线。 2． 1． 7 小鼠血糖含量测定 按葡萄糖氧化酶法测 定血糖含量［8-9］。 2． 1． 8 糖尿病动物模型的建立 取健康的雄性 KM 小鼠，给药前禁食 24 h，称重，按 40 mg·kg － 1 剂 量于其尾静脉注射 3% （ w / v） 的四氧嘧啶溶液，正常 饲养 72 h 后禁食 12 h，尾静脉取血0． 2 ml。待血液 凝固后，12 000 r·min － 1 离心 4 min。精密量取血清 20 μl，采用葡萄糖氧化酶法测其血糖含量，血糖值 高于16． 67 mmol·L － 1 的为糖尿病模型的小鼠［10］。 2． 1． 9 糖尿病小鼠降血糖研究 取糖尿病小鼠 24 只，称重，随机分成 4 组，每组 6 只，实验前禁食 12 h，可自由饮水，灌胃给药。分别给予 PBS 溶液，胰 岛素 PBS 溶液（50 IU·kg － 1 ） 、胰岛素纳米粒（50 IU· kg － 1 ） ，皮下注射胰岛素（5 IU·kg － 1 ） ，在 0，1，2，4， 6，9，12 h 尾 部 静 脉 取 血 0． 2 ml，待 血 液 凝 固 后， 12 000 r·min － 1 离心 4 min。精密量取血清 20 μl，采 用葡萄糖氧化酶法测定其血糖值。然后采用梯形法 计算血糖下降百分率-时间曲线上的面积 AAC，采用 药理相对生物利用度（ 相对皮下注射胰岛素溶液） 来评价胰岛素的药物相对生物利用度［11］：
［基金项目］ 国家 自 然 科 学 基 金 （ 编 号：50973088 ） ［作 者 简 介］ 李 心 愿，男，研 究 方 向： 药 物 新 剂 型 研 究，电 话：027-87859029，E-mail： 780812464@ qq． com ［通讯作者］ 张雪琼，女，研究方向：药物新剂型研究，电话：027-87859019，E-mail：365464583@ qq． com
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中国医院药学杂志 2015 年 5 月第 35 卷第 10 期 Chin Hosp Pharm J，May 2015，Vol 35，No． 10
羧甲基壳聚糖（ CMC，相对分子质量17． 4 kDa， 脱乙酰度 85% ，青岛弘海生物技术有限公司） ；猪胰 岛素（27 U·mg － 1 ，相对分子质量为5 807，徐州万邦 金桥制药有限公司）；氯化钙（ 天津市恒兴化学试剂 制造有限公司）；葡萄糖试剂盒（ 上海士峰生物科技 有限公司） ；四氧嘧啶（ 美国 Sigma 公司） 。